搜索
SPF鸡（胚）分析报告第一章SPF鸡（胚）概述一、基本定义SPF(SpecificPathogeFree)鸡即无特定病原鸡，一般指饲养于可控环境中，不能检出国际、国内(尤其是国内)流行的鸡主要传染病的病原，具有良好的生活力和繁殖性能的鸡群。其所产的受精卵即为SPF鸡胚。SPF鸡及SPF鸡胚因其微生物学上的相对纯净性而成为病毒学、营养学、病理学研究及生物制品生产、检验中不可缺少的标准实验动物和实验材料。二、SPF鸡（胚）的起源及发展实验动物在科研、疾病诊断、疫苗、血清制品及输液和其它药品的管理方面是一项基础的工作，是科学研究的支撑平台和活的试剂。SPF鸡如同其它种等级实验动物一样，也是由不断发展的需求催生出来的。1911年，Rous和Murphy首次将鸡胚应用于病毒研究，但早期的研究者并没有意识到鸡胚可能携带不需要的病原微生物，而这些感染的病原微生物可能会影响实验的准确性，直到Woodrut和Goodpasture在研究禽痘病毒时，才开始意识到鸡胚中隐性病毒的危害。1899年M．Schottelines首先尝试培育无菌鸡。1908年M．Cobendy，1935年Kimura，Naito和Kobayashi，1943年I．AReynievs和P．C．Trexier等先后获得了无菌鸡；1948年，Loband小组饲养的无菌鸡产卵，并孵化成功。不同于哺乳实验动物通过剖腹产的方法获得无菌动物，最早的无菌鸡是由高龄健康母鸡传代获得的。这些鸡尽管所产种蛋有较高的母源抗体，但几乎不携带致病微生物，孵化后放入隔离器中，经不断选育、检测，最终获得了无菌鸡。从上世纪初到60年代，由于美国家禽养殖业的发展和禽病研究的需要，人们越来越认识到鸡胚中可能携带垂直传播的病原和获得清除了这些病原的鸡和鸡胚的必要性。由于无菌鸡的饲养和维持非常昂贵，不利于大规模应用，而通过无菌鸡选育培养得到的SPF鸡即经济又健康，同时知其微生物状态，随着二十世纪七十年代以后,空气净化等技术的发展,为SPF动物的饲养提供了可靠的技术保证，饲养量迅速增加，利用SPF鸡胚和SPF鸡来生产生物制品就成为必然。1959年，美国农业部地区家禽研究所建立了实验性的SPF鸡群。1961年，SPAFAS公司成为了世界上第一家商业性SPF鸡生产企业，1965年开始向市场出售SPF种蛋。从那时起，SPF鸡和种蛋获得了越来越广泛的应用。我国SPF鸡群的饲养,开始于20世纪80年代。山东家禽研究所朱果等设计建设了一组净化实验室,饲养SPF鸡群获得成功。从此,中国兽医药品监察所、北京市兽医生物药品厂、北京实验动物中心等单位先后建成了生产规模的SPF鸡群,并将SPF鸡群应用于疫苗生产。此后,SPF种蛋在科研和疫苗生产中的应用逐步扩大，目前我国约有20家左右的SPF种蛋生产单位。第二章SPF鸡（胚）的生产及应用一、SPF鸡的生产1、优质的SPF鸡种源目前我国SPF鸡种源主要依靠国外引进，不仅耗费大量外汇，而且由于商业垄断因素，种源很难提供，引进的种蛋遗传背景资料不清，近交程度不确切，生产性能不高，而且由于质量控制标准的不同，存在潜在的外源病毒风险。这不仅严重影响生物制品生产和科研的重复性和稳定性，而且是对昂贵设施的巨大浪费。因此，培育优质高产的SPF鸡种鸡群成为一项迫切的任务。欣慰的是，哈尔滨兽医研究所、山东省家禽研究所等单位在SPF种鸡群的培育方面已经作了大量的基础工作，或加以政策的支持和引导，必能为我国SPF鸡产业的持续发展起到有力的促进作用。2SPF鸡的生长环境SPF鸡的环境包括气候因素、物理、化学因素和居住因素、营养因素和生物因素在下面分项单独叙述。2．1居住因素目前SPF鸡的饲养设施有两种：一是隔离系统，也就是通常所说的隔离器，材质有玻璃钢、不锈钢等；二是屏障系统，以一定建筑围护结构配以净化通风系统等设备以便大规模饲养的设施，材料有彩钢板、玻璃钢、不锈钢和砖混等。隔离系统由于人与动物不直接接触，可长时间保持鸡群的微生物学状态，最适于保种，但其空间狭小，单位造价昂贵，不适合大规模饲养。屏障系统单位造价较低，空间可扩展性高，适于大规模饲养，可有效降低成本。但由于动物与人直接接触，不利于保持鸡群的微生物学状态，一定时间后必须重新引种，更换种群。但不管哪种设施，都要求围护结构有良好的气密性，耐腐蚀、耐冲击、耐消毒，不易产尘和无眩光。屏障系统以笼具饲养SPF鸡，铁质的居多(冷拔钢丝网片镀锌或镀塑)，也有不锈钢制的，但因造价高极少应用。因不同阶段可分为育雏笼、育成笼、成鸡笼等；食槽多工程塑料制，耐冲洗、耐腐蚀；饮水设备一般为乳头式饮水器。2．2气候因素和物理、化学因素在SPF鸡的日常饲养中，这两种因素是最主要的，尤其是换气次数、净化级别和落下菌数。只有有效控制了这些环境因素，SPF鸡才有可能健康生长、生产和繁殖。SPF鸡环境及设施指标国家标准(GBl4925．2001,见附件1)。3SPF鸡的饲料与饮水3．1SPF鸡的营养标准目前，发达国家都有自己的SPF鸡标准的饲料配方，但国际上还没有通用的饲养标准，只有参考标准，国内外差异并不大。国内外的饲养标准见附件2。3．2SPF鸡饲料的灭菌SPF鸡的饲料不允许在其中添加抗菌素类药物，都需要经灭菌才能饲喂SPF鸡。灭菌一般有二种：钴60辐照法和高压蒸气灭菌法。3．2．1钴60辐照灭菌时先将饲料用真空包装机抽空打包，一般根据鸡舍的每日需要量确定单包重量，然后以钻60辐照，吸收剂量一般为250万拉德。这种方法营养损失较少，饲料储存期长，但造价较高，且受钻60源分布地点影响。3．2．2采用高压蒸汽灭菌法时，先将饲料分装小包，包装材质应透气、耐高温、高压，重量以平铺于网栅时厚度不超过3cm为宜，一般以121℃20分钟即可达到灭菌目的，更高温度短时间灭菌也可以达到效果。这种方法营养损失较多，饲料储存期短，但造价较低，且方便、快捷。3．2．3灭菌后的饲料必须进行细菌学检查，阴性者方可饲喂。另外要定期检查灭菌饲料的营养成份，营养缺失部分要及时补充。3．3SPF鸡饮水的消毒SPF鸡饮水的消毒方法有很多，如煮沸，反渗过滤法，臭氧发生器消毒法，盐酸酸化法等，其中以盐酸酸化法应用最为广泛。一般将饮水置一容器中，按体积以1：1000比例加入浓盐酸，以pH试纸测定pH值在2．0左右，作用1小时后即可达到良好的灭菌效果，可以使用。SPF鸡饮水一般比照普通鸡不同阶段的需求量，根据实际需要保证供给。4严格的SOP体系建立SOP即标准操作程序(StandardOperationProcedure)，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。针对SPF鸡的生产管理，制定各种规章制度，以及生产中的各种操作规范，就是将生产程序中的关键控制点进行细化和量化。严格、科学的SPF鸡群群饲养管理制度是培育、生产出高质量鸡群的必要条件。为此，必须应用SOP控制所有人流、物流和动物流，规范人员的进出和操作。使得人员操作规范统一，保证了实验动物生产的各个环节一致，减少人为操作带来的风险。5可靠的SPF鸡群质量检测技术定期对SPF鸡群进行抽样检查，是了解鸡群健康状况，判断SPF鸡群是否保持SPF状态的必要手段。严格而准确的微生物监测是进行SPF鸡正常生产的关键措施。国际上SPF鸡群的微生物控制标准不同，但有共识。主要的包括美国农业部兽医科技备忘录（800.65）、欧洲药典规程和中华人民共和国国标GB/T17999.1-2008，我国企业的质量控制依照GB/T17999.1-2008规定。二、SPF鸡的国家质量检测标准与监测方法检测的病原种类由不同的国家和机构制定标准，主要标准包括美国农业部（USDA）标准、欧洲药典、中华人民共和国国标GB/T17999.1-2008等。由于人们对疫病的认识有一个不断深化的过程，因此特定病原的含义也在不断的发展和完善。一般来说，国际上控制的鸡传染病仍以16种传染病为主,即1种细菌病（鸡白痢，SP），2种霉形体病（鸡毒霉形体MG，滑液囊霉形体MS）和13种病毒病（鸡痘FP、鸡新城疫ND、禽白血病AL、禽脑脊髓炎AE、网状内皮增生症RE、鸡马立克病MD、传染性喉气管炎ILT、传染性法氏囊炎IBD、禽呼肠孤病毒ARO、禽腺病毒AA、产蛋下降综合症EDS76、禽流感AI和传染性支气管炎IB),这个标准是国际统一的。在这16种传染病当中，着重控制4种经卵垂直传染的传染病：鸡白痢、鸡毒霉形体病、滑液囊霉形体病和禽白血病。各国根据不同国情，不同疫病流行状况，在此基础上又增加或减少了一些控制项目，我国的国家标准（GB/T17999.1-2008，见附件3）中增加了副鸡嗜血杆菌（HP）、多杀性巴氏杆菌（PM）、鸡传染性贫血病毒的检测，相应减少了产蛋下降综合症的检测。这些疫病的检测方法主要有:琼脂扩散法(AGP)、血清平板凝集实验(SPA)、血凝抑制实验(HI)和酶联免疫吸附实验(ELISA)等。各生产SPF种蛋的公司,根据供应SPF种蛋的不同用途,确定不同的标准,采用不同的检测项目和检测方法。标准越高,被检测的项目越多,方法越复杂,SPF种蛋的价格就越贵。一般来说,供传代或研究用的SPF种蛋较贵,做疫苗生产的SPF种蛋便宜一些。需要指出的是,药厂在签定SPF种蛋供应合同时,一定要将种蛋的标准、检测项目、检测方法、抽检比例、间隔时间以及发现问题后的处理等项内容列出,以确保合同双方的利益。大多数检测样品为血清和种蛋，特殊情况下可检测羽髓(MDV)或进行细菌分离。采集方式为随机，应尽量扩大监测范围，增加代表性，检测种蛋有两种目的：一是检测种蛋中是否含ALV群特异性抗原(P27蛋白)；二是评价鸡胚对AEV的敏感性。现行国家标准中规定的监测周期是根据经济成本，病原微生物感染扩散所需时间，易检出最佳时间，该微生物在SPF鸡微生物控制中的重要性等诸方面因素综合确定的。我国标准规定：开产前，100％抽样，检测ALV、MG、MS和SP产蛋期，每隔6～8周，按5％～15％采样，检测标准规定的所有项目。种蛋采集应新鲜。ALV的检查，每群送检200枚蛋(少于200只的鸡群全群取样)，每只取蛋1枚。AEV鸡胚敏感试验，每群50枚(少于50只的鸡群全群取样)，每只取蛋1枚，其它病原微生物感染检测时，产蛋鸡按5％抽样，少于200只的鸡群按10％～15％抽样。三、SPF鸡（胚）的应用价值1、为禽病研究提供优良的实验动物用SPF鸡作为实验动物，可排除非研究病原体的干扰作用。作为实验感染，有利于对疾病发生、变化进行分析。试验结果可为防治措施的制定提供可靠科学依据。实验动物科学是医学、生物学发展的重要基础。按微生物控制程度对实验动物进行分类,共分成5个不同级别,即普通动物、清洁动物、无特定病原(SPF)动物、悉生动物和无菌动物,不同的科学实验需要不同级别的实验动物。普通动物和清洁动物由于在普通环境下饲养,暴露在微生物的环境中,可能带有不同抗体,会干扰实验结果,应用受到一定限制。悉生动物和无菌动物由于培育和饲养都相当困难,价格昂贵,因此仅在发病机理等基础理论的研究中应用。而SPF动物界于二者之间,虽在屏障系统内饲养,却仅排除了各种已知传染病的干扰,对维持动物正常生理活动的有益细菌未加限制,保证了动物的正常生理需要,降低了饲养难度和饲养成本。这些有益细菌又不会干扰实验结果,所以SPF动物可以满足很多试验的要求,得到了极为广泛的应用。由于SPF动物不携带特定病原,因此世界卫生组织向世界各国推荐,要把SPF动物作为人用和兽用疫苗的动物性原材料。要证明一个生物学规律,必须有合乎标准的实验动物。这个标准必须统一,才能进行交流,进行实验数据的比较。一个生物学试验,不论设计多么合理,实验多么精细,只要实验动物不符合要求,就不会被国际学术界承认。毫不夸张地说,实验动物和动物实验的水平,标志着一个国家的科学水平。要发展兽医科学,必须高度重视实验动物。在没有使用SPF动物之前,有时可以见到这样的报道:某种病毒的鸡胚最小致死量为若干毫升病毒原液,但其他人几乎不可能重复这个实验。或报道:某两种病毒在同一个鸡胚里可以共同