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血凝抑制（HI）试验操作规程1.仪器、设备和试剂的准备1.1仪器及设备V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的八道加样器、小圆底试管、吸管。1.2抗原和试剂：1.2.1相应HI抗原1.2.2相应阳性血清1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）1.2.41%鸡红细胞悬液1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。按上述步骤，用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的压积）。1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细胞悬液。（按照需要量配制）1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心5分钟，红细胞压积应为0.6ml2．HI抗原工作液配制2.1HI抗原血凝价测定血凝试验：1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。表1病毒血凝试验孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果图1如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:5122.2HI抗原工作液配制及检验2.2.14HA100单位的抗原配制4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA100单位的抗原=512/4=1282.2.24HA100单位抗原的检验4HA100单位抗原的检验按表2进行。检查血凝价是否准确，应将配置好的4HA100单位的抗原再用生理盐水稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1;4、1:5、1:6、1:7。将每一稀释度的抗原25ul加入生理盐水25ul，最后加入1%鸡红细胞悬液25ul，用微量振荡器中速振匀，置室温（20~25℃），20~30分钟后判定结果。将血凝板在20~25℃下放置20~30分钟后，如果1:4稀释度是100%红细胞凝集终点，说明配制的是4HA100单位的抗原；如果100%红细胞凝集终点是1:5或1:6说明配制的4HA100单位抗原实际上高于4个单位；如果100%红细胞凝集终点是1:2或1:3说明配制的4HA100单位抗原实际上低于4个单位。使用时应根据检验结果做适当调整，使抗原工作液确为4HA100单位表14HA100单位抗原的检验孔号：1234564HA100抗原的稀释度1:21:31:41:51:61:7稀释的4HA100抗原252525252525生理盐水2525252525251%鸡红细胞悬液252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果2.2.34HA100单位抗原的调整稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x原4HA100单位抗原的稀释倍数/4图2如图2所示，使100%红细胞凝集终点的稀释倍数为1:3，说明配制的4HA100单位抗原实际上低于4个单位，所以调整后的4HA100单位抗原稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x原4HA100单位抗原的稀释倍数/4=3X128/4=96按1:96稀释禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，制成4HA100单位抗原。3．血凝抑制试验（HI）3.1取96孔微量反应板，分别向1~12孔中加入25ul生理盐水。3.2吸取25ul待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取25ul至第二孔，依次2倍稀释至第十孔，从第十二孔中吸取25ul弃去。3.3每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同3.23.4分别向1~12孔中加入含4HA100单位的抗原25ul，微量振荡器中速混匀后室温（20~25℃左右）静置20~30分钟。3.5每孔中加入25ul1%鸡红细胞悬液，微量振荡器上轻轻震荡均匀，室温下（20~25℃）静置20~30分钟。3.6结果判定凝集现象表现为红细胞平铺在V型管底壁，凝集严重时红细胞膜片边缘可能出现卷边现象。未凝集的红细胞在V型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。将反应板倾斜45度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为100%抑制。当阴性血清HI效价≤2log2、阳性血清HI效价与已知结果相比误差≤1log2时，试验方可成立。以完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度作为HI效价。表396孔板微量法血凝抑制试验孔号：123456789101112血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水252525252525252525252525被检血清2525252525252525252525弃去4HA100抗原252525252525252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后加入红细胞悬液红细胞悬液252525252525252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果图3如图3所示，抗体1完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第10孔，故其效价为1:1024；抗体2和抗体3完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第9孔，其效价为1:512，阴性血清完全凝集，阳性血清与已知效价一致，因此该结果成立。附：阿氏液配方：葡萄糖2.05克柠檬酸钠0.8克柠檬酸0.055克氯化钠0.42克加蒸馏水至100毫升，调PH值至6.1，115度，10分钟灭菌。4度保存。使用比例：静脉血液与阿氏液1:1。PBS1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.28g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.15g，氯化钠(NaCl)：8g，加去离子水定容到1L。抗凝剂配方：柠檬酸钠3.8g加蒸馏水至100毫升，10分钟灭菌。4度保存。使用比例：静脉血液与抗凝剂1:9。