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11第6章中性样品：反相与正相HPLC6-1引言如1-4节中所论述，HPLC方法建立的最佳途径由样品的性质决定。本书中所推荐的HPLC方法建立策略按一般样品或特殊样品进行分类，见图1-3。一般样品又分为中性样品和离子样品，离子样品包括含有一种或多种离子的或可电离的化合物（如酸、碱、有机盐）。本章讨论仅含有不可电离化合物的中性样品。而离子化合物的HPLC方法建立将在第7章中讨论；不过这里所讨论的许多中性化合物的分离方法也同样适用于离子样品。对于同时含有中性和离子样品的HPLC方法建立在第9章中讨论。第一部分反相色谱反相色谱（RPC）是分离大多数常规样品的首选分离模式，该模式的普适性一般比其它液相色谱模式更好，更方便，获得令人满意的最佳分离效果的可能性更大。RPC色谱柱柱效高、稳定、重现性好（见5-3节）。所采用溶剂的性质决定了这种模式往往更易于检测（尤其是UV检测器），因此大多数色谱工作者采用RPC分离模式多于其它HPLC模式。尽管许多有机化合物在（水溶液）流动相中溶解度有限，但由于RPC的进样量很少（纳克或微克）（见2-4节），实际上并不会影响其应用。当样品在RPC流动相中溶解度太小时，正相色谱（NPC）则是较好的选择。同样，那些在水溶液中不稳定的样品也可用非水溶剂以NPC模式进行分离。有些样品用RPC分离较困难，必须采用其它模式进行分离。含下述化合物之一的样品为特殊样品（见图1-3）：强亲水或强疏水化合物、非手性异构体、手性异构体（即对映体，见第12章）、生物大分子（见第11章）。无机离子或合成聚合物也很“特殊”，但本书中不作讨论。强疏水样品由于在RPC中被强保留，可能需采用非水条件（非水反相色谱或NARP，见6-5节），正相色谱（NPC）也可进行这类分离（见本章第二部分）。强疏水的生物大分子则可采用疏水作用色谱（HIC）分离，将在第11章中讨论。强亲水样品在RPC中往往保留不足，亲水离子样品的分离祥见第7章的讨论。由于中性亲水化合物在NPC柱上保留很强，用NPC分离很好（见6-6与6-7节）。某些亲水化合物也可以采用亲水作用色谱（HILIC）进行分离（详见6-6-5节与第11章的讨论）。非手性异构体（包括立体异构体、非对应异构体、位置异构体等）可以采用某些RPC条件分离。但异构体混合物通常采用NPC（见6-7节）或以环糊精键合固定相的RPC（见6-3-3节）进行分离，手性对映体的分离须用特殊条件，详见第12章的讨论。6-2反相色谱的保留RPC的保留机理如图6-1所示。RPC分离类似于从水中萃取不同化合物至有机溶剂（如辛醇），疏水（非极性）化合物更易于萃取至非极性的辛醇相中。色谱柱（一般用C8或C18键合相修饰的硅胶担体）的极性弱于（水-有机）流动相。样品分子在极性流动相和非极性固定相间进行分配，疏水强的（非极性）化合物保留较强。因此，对于一定组成的流动相，样品依其疏水性，保留值不同，所得色谱图如图6-1所示。亲水（极性）组分保留较弱，先从柱上流出；疏水（非极性）组分后流出；中等极性组分居中流出。化合物的RPC保留值由其极性和实验条件（包括流动相、色谱柱和柱温）决定。如表6-1所示，有数种方式可改变RPC中大多数组分的保留值。虽然仍不清楚反相保留的详细机理，但保留值可以通过分配过程近似估算出。不考虑保留机理，人们对改变实验条件（流动相、色谱柱、柱温）产生的影响已作了深入的研究，因此可以系统地研究RPC的方法建立22（如本章和第9章所述）。极性非极性亲水性0123456789101112131415161718疏水性图6-1非离子样品的反相分离过程示意图黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子6-2-1流动相的影响通过改变流动相组成或溶剂强度调整保留值（k值）较好。在RPC中，采用弱极性的强流动相相对溶质保留值较小。溶剂的极性可由极性指数P‘表示（见附录Ⅱ中表Ⅱ-2）。溶剂强度取决于所选用的有机溶剂和其在流动相中的浓度：%B，一般A代表水，B代表有机溶剂，%为体积百分比。方法建立的初始目的是使所有样品化合物有适宜的保留值。如第2章所述，用等度条件分离样品时，容许的保留值范围为0.5k20，不过1k10一般更好。表6-1RPC中改变保留值的方法减小保留增大保留提高柱极性（氰基、C4）降低柱极性（C8、C18）降低流动相极性（提高%B-增加有机溶剂）（减少极性有机溶剂）提高流动相极性（降低%B-增加水）（增加极性有机溶剂）提高温度降低温度6-2-1-1%B的选择方法建立的有效步骤是先以极强的流动相开始试验（如图6-2中的100%ACN）。使用强流动相有可能使首次的运行时间很短，强保留化合物可全部流出。（注意：若采用100%ACN，在30~40min后仍不出峰，应考虑采用其它办法；见第9章）。用100%ACN时，全部组分接近于t0流出（k0.2），所以需减弱流动相。当ACN浓度以20%的步长递减到80%和60%时，分离效果如图6-2，但两次运行首峰（t0=1.0min，k0.5）的保留结果都不能令人满意。50%和40%ACN（都可达到0.5k20）均有足够的保留。若流动相非常弱（30%ACN），则化合物D的保留值会太长（k20，如图6-3中D线所示）。注意用50%与40%ACN时，4种化合物均已达到分离，40%ACN的分离度略好一些（化合物B与C的Rs=2.0），其代价是运行时间更长。很多样品可以采用溶剂强度调整保留值的办法充分分离。图6-3用图6-2的保留数据，以logk对%B作图得到。K=0.5和k=20的横虚线规定了保留值可接受时的最小和最大%B值：30%~56%B（竖虚线）。RPC保留值与%B依赖关系的33研究已很详尽。logk与%B之间基本呈线性关系（见图6-3）：logk=logkW-Sφ（6-1）其中kW是仅以水为流动相（0%B）的理论k值，S对特定组分为常数，φ是有机溶剂在流动相中的体积分数[φ=（%B/100）]。大多数小分子量（500Da）化合物的S≈4。式6-1和S≈4的结果说明每减少10%的B相，k值约增大2~3倍，如图6-2所示。例如当流动相由40%B减少到30%B，化合物D的k值则由9增至23（见图6-3）。3倍规则（每降低10%B，k值增加大约3倍）对于快速估算所有样品组分的保留值均可接受时的最佳%B值非常有用。024650%乙腈ABCD020280%乙腈02460%乙腈100%乙腈A0642C40%乙腈DB812t/min10图6-2改变有机溶剂浓度对样品RPC分离的影响条件：15×0.46cmC18柱，流速：1.5ml/min（t0=1.0min）。通过系统地降低%B值（如图6-2）来研究样品保留值，对选择特定样品的最佳流动相组成是一种非常简便的办法。用梯度洗脱则是另一种更快捷的方案（见8-2-2节）。6-2-1-2流动相强度RPC中的流动相强度由%B和有机溶剂种类共同决定。这些影响见图6-4中三种常用RPC溶剂：乙腈（ACN），甲醇（MeOH）与四氢呋喃（THF）的溶剂强度计算图。图中的竖线对应位置为具相同流动相强度（k值）的%B值。例如：40%ACN的k值和运行时间应与50%MeOH和30%THF相似。标度略不同的流动相强度图也有报道。这些不同的标度图非常相似，只能在样品分离时作为粗略参考（准确度±5%B）。图6-4在RPC方法建立中的应用将在6-3-2和6-4-2-2节中作深入讨论。44图6-3图6-2中样品化合物保留值（logk）与流动相强度（%B）的关系图图6-4及其它文献数据认为RPC中溶剂强度顺序为：水（最弱）甲醇乙腈乙醇四氢呋喃（THF）丙醇二氯甲烷（最强）。可见溶剂强度随着溶剂极性的降低而增加。附录Ⅱ中收录了一些常用溶剂的极性指数P‘。01020304050607080901000204060801000102030405060708090100乙腈/水甲醇/水四氢呋喃/水图6-4反相HPLC的溶剂强度计算图除了二氯甲烷与水不混溶外，上述溶剂都可在RPC与水共用。由于二氯甲烷很强，可用于清洗被强保留样品组分污染的RPC柱（见5-4-3-2节）。乙腈（ACN）是流动相中有机溶剂的最佳首选，ACN-水流动相可用于低波长（185~210nm）UV检测，这对于许多样品是非常必要的（见3-2-2节）。另外，ACN-水流动相的黏度非常低，塔板数较高而柱压较低（二者均为理想性质）。有机溶剂的第二首选是甲醇（MeOH），再者则是四氢呋喃（THF）。这3种溶剂广泛用于RPC中，控制选择性与分离（见6-3-2节）。THF的缺点是：UV吸收高，遇氧会发生反应，更换流动相后色谱柱平衡较慢等。但据报道THF有独特的选择性。55用100%ACN无法将样品洗脱出色谱柱的情况时有发生，这些强疏水样品需用更强的流动相（如高浓度THF-水或THF-ACN）。流动相不含水的HPLC模式称为非水反相液相色谱（NARP），详见6-5节中的讨论。6-2-2色谱柱和柱温的影响RPC分离通常使用硅胶基质的键合相柱（见5-2-3节）。样品的保留值由色谱柱的三个特性决定：柱类型、键合相浓度、柱表面积。保留值随键合相的性质而有所不同，通常随链长的增加或键合相基团疏水性的增强而增大。例如，C18柱的保留值通常略大于C8柱（包括键合相密度等其它条件相同）。非极性、非离子化合物的RPC保留值通常遵循以下规则：（弱）未键合硅胶≤氰基C1（TMS）C3C4苯基C8≈C18（强）（6-2）图6-5所示为非极性（蒽）与极性（二乙基邻苯二甲酸盐）在不同商品柱上的保留值关系图。当其它条件等同时，聚苯乙烯与多孔石墨碳柱（见5-2-3-2节）比C18柱的保留更强。柱强度可由键合相判定，如氰基柱较弱，而C18柱较强。另外，k值与柱表面积成正比。普通柱填料（8nm孔隙）的表面积大约250m2/g，而30nm孔隙颗粒的表面积大约60m2/g。当其它条件相同时，30nm孔隙（低表面积）色谱柱的k值大约为8nm孔隙色谱柱的k值的1/4（60：250）。因此，大孔隙（表面积低）的氰基柱很弱，其保留值大大低于小孔隙（表面积大）的C18柱。改变色谱柱强度可以控制样品的保留值（k范围），而大多数情况下，改变溶剂强度（%B）更为有效和方便。但有两种例外应注意：疏水性强的组分保留也强，有时即使采用NARP条件（见6-5节）也不可能从强色谱柱（如小孔隙C18柱）上洗脱出来。这种情况下用较弱的色谱柱（如大孔隙的氰基柱）可能会使样品较快洗脱出来。同样，用小孔隙、强保留的C18柱或（尤其是）石墨碳柱，则利于强亲水样品的洗脱。对于非离子样品，通常柱温增加10C，k会减少1~2%，因此可通过改变温度来控制样品保留值（k范围），这与改变%B类似。但这种方法在RPC中并不常用，因为改变溶剂强度更加有效。对于疏水性极强的样品，在较高温度下采用极强流动相（NARP见6-5节）和极弱色谱柱效果更好。6-3反相色谱的选择性调整样品保留值k的范围仅是获得充分分离的第一步。当整体保留值令人满意时（即0.5k20），可能有必要改善不同谱峰的峰间距或选择性（α）。RPC中用来改变中性样品选择性的主要参数有三个：流动相组成、柱类型和柱温，其中改变流动相的组成通常最为有效且方便，故应首先考虑。改变温度虽然非常方便，但对α值的改变通常较小，不过α的很小改变有时可足以分离许多样品。6-3-1溶剂强度的选择性降低%B的主要影响是导致各样品组分的k值增加。如图6-2所示，%B的改变使化合物A~D的k值发生了类似的改变。当%B从30%增加到56%时（0.5k20范围内），相邻峰对（如化合物B/C）的选择性（α）变化不大，虽然%B的降低使分离度不断增加。但其它情况下，相邻峰间距会随%B显著变化。这种溶剂强度选择性的说明见图6-6的示例。采用60%与50%ACN分离时，A/B是关键峰对（即采用50%ACN的流动相时，化合物A与B的分离度较差）。由于降低%ACN能改善A与B的分离，所以当溶剂强度进一步降低至40%ACN时，这两个峰的分离将更好，如图