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11第7章离子样品：反相，离子对和离子交换HPLC7-1引言图1-3中的讨论将常规样品分为2类：中性样品和离子样品。离子样品是任何含有一种或一种以上离子的或可解离的有机化合物的混合物。中性样品的分离已在第6章讨论；本章讨论离子样品的反相，离子对和离子交换HPLC的分离。一些离子样品也包含在图1-3中特殊样品范畴中：生物样品（见第11章）、手性样品（见第12章）和无机离子。无机离子的分离在本书中不作讨论。离子样品的HPLC分离往往更复杂且难于理解。而且，往往有一些中性化合物碰不到的问题。另一方面，离子样品的谱峰间距比中性样品更易于控制，这一点使最终分离成功的可能性大为增加。7-2酸性和碱性样品为方便本章的讨论，我们定义“离子溶质”为在通常pH范围内（大多数硅胶基质色谱柱：2pH8，以及pH稳定柱：1pH14），含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。强酸或强酸碱是在所研究pH范围内完全解离的化合物[如链烷磺酸（pH2、四烷基铵盐（pH13）或大多数pH8的烷基胺）。在HPLC分离条件下离子电荷随pH发生变化的化合物简单地称作酸或碱。如流动相pH被限制在较窄范围内，某特定酸（如醋酸）的保留行为可能与强酸（pH7，完全解离），酸（3pH7，解离度随pH变化）或中性化合物（pH3，不解离）的类似。同理，碱的分类方式也类似。7-2-1酸碱平衡与反相保留在反相色谱（RPC）中，疏水化合物样品的保留值较大（见6-2-1节）。当某种酸（HA）和碱（B）发生解离（即从不带电形式转化），其疏水性将会大大减弱（亲水性增强）。因此，在RPC中的保留值k可能下降10~20倍。HA＜＝＞A-＋H+（7-1）B＋H+＜＝＞BH+（7-2）疏水亲水（RPC中保留较强）（RPC中保留较弱）当pH增加，酸失去质子（发生解离）；而当pH降低时，碱获得质子（也发生解离）；因此随pH增加，酸的RPC保留值减小，而碱的则增大。该保留值行为的说明见图7-1所示5种不同化合物的RPC保留值随流动相pH值变化的关系图。在3pH9的范围内，化合物1与2呈酸性，化合物4与5呈碱性，3为中性。图7-2a进一步阐述了这种酸碱行为，一种碱性化合物（理想的）保留与pH的关系。当pH值在一足够大的范围内发生变化，样品的解离和保留值如图呈特有的S形曲线（亦见图7-1中的化合物4）。在该保留值-pH曲线的中点（见图7-2a中虚线），pH值等于该化合物（就碱来说为BH+）的pKa值。文献中的不同酸或碱的pKa值通常指在水缓冲剂中的测得值。如果HPLC流动相中含有有机溶剂，其pKa值可随%B有所变化（见7-2-3节）。当一种化合物的pKa=pH时，其有一半解离（即流动相中B与BH+的浓度相等）。几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于pKa值±1.5单位的pH值范围内（见图7-2a的B区域）。超出该范围（图7-2a中为pH2.5或pH5.5），该化合物或者完全解离或者完全未解离，其保留值随pH变化不大（即保留行为与中性化合物相似）。该情况见图7-1所示，当pH6时的化合物1，与pH7时的化合物2的情况。如化合物含有多个酸和╱或碱基，其RPC保留值与流动相pH的关系则更为复杂。当22这些基团相同时（酸性或碱性），其保留值与pH的关系基本相似，如图7-3a中所示的一系列含有一、二、五与七个可解离的酸性基团（-COOH）的化合物[（蝶酰基低聚）谷氨酸]。而当一个分子中同时存在一个酸性和一个性碱基团时，（两性）保留行为更复杂，见图7-3b所示的几种氨基酸的RPC分离。中间pH值处保留值最小，因为4pH8时，羧基与氨基都发生解离；这时分子解离程度最大，亲水性最强（尽管静电荷为零）。357910203040洗脱液的pH值保留体积（ml）碱中性酸性酸性碱45321图7-1流动相pH对反相保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系色谱柱：30×0.4cmμBondapakC18，流动相：0.025M磷酸盐、40%甲醇；化合物：1水杨酸；2苯巴比妥3非那西丁4尼古丁5甲基苯丙胺。7-2-2缓冲液的选择当分离酸性或碱性样品时，加入缓冲剂控制流动相的pH是非常可取的。（用pH计）很难精确测定含有有机溶剂的流动相的pH，因为电极响应易发生漂移。因而，如使用pH计，最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂。这就使最终流动相的实际pH值难以确定（因为加入有机溶剂会改变pH），但该问题比流动相pH重现性不好要大得多（即当加入有机溶剂后，再测pH值）。选择具体缓冲剂时，应切记的几种考虑因素：缓冲容量UV吸收度其它性质：溶解度、稳定性、与样品和╱色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等。7-2-2-1缓冲容量缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定。与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解离的pH范围为pKa±1.5。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。因此，为了保险起见，为某具体分离所选择的缓冲剂应控制的范围pH≈pKa±1.07-2b下的讨论）。假定进样体积较小和╱或样品对流动相pH的影响不很大，10~50mM浓度的缓冲剂对RPC分离一般足够。较高的缓冲剂浓度（50mM）可以提供较大的缓冲容量，但在高%B的流动33相中可能不溶。高浓度的缓冲剂也可能对不锈钢材质的HPLC系统操作不利。25mM的缓冲剂浓度通常是较好的折中方案。表7-1中总结了HPLC中几种常用缓冲剂的可用pH范围数据。234567ABCpka+-1.5pka保留时间pH(a)(b)pH=3.0pH=3.5pH=3.75pH=4.0图7-2保留值和缓冲容量与pKa和pH的关系（a）对于pKa=4.0碱性化合物，保留值对pH的理想的依赖关系，（b）当流动相缓冲容量减小时峰形变差的情况。3，5-二甲基苯胺作为溶质（pKa=3.8）；25×0.46cm氰基柱，25%MeOH-缓冲溶液（25mM磷酸钾），1ml/min，350C；用具有临界缓冲容量的流动相，难以保证那些在流动相pH值下部分解离的化合物的分离重现性。这种情况下，每次运行的保留值都可能发生变化，产生畸峰。如图7-2b所示，用25mM磷酸盐缓冲剂在pH值介于3与4时，3，5-二甲基苯胺（DMA）的RPC分离。缓冲剂的pKa值为2.1，所以当流动相pH3.1时，其缓冲容量将显著降低。在这些实验条件（25%MeOH-缓冲剂）下，溶质（DMA）的pKa为3.8（即2.8pH4.8，将部分解离）。从图7-2b中可以看出，随pH值增加到3以上（降低缓冲容量），溶质的峰形逐渐变差，而且，当pH3.5时（缓冲容量非常小，见7-2-2-4节的进一步讨论），峰变形已相当严重。7-2-2-2缓冲液的紫外吸收理想状态下，缓冲剂应在或者低于220nm处透光性良好，以便于在低UV波长处检测。表7-1中的所有缓冲剂（除枸橼酸盐外），都满足该标准。有时，有必要在200nm或以下进行UV检测。表7-1中的几种缓冲剂（磷酸盐、碳酸盐、铵盐）能在非常低的UV波长检测。然而缓冲剂由于含有杂质，在低UV波长的吸收度可大大提高。表7-1中的UV截止波长所指是纯试剂的。7-2-2-3缓冲液的其它性质4402.03.04.05.06.07.0242220181614121086保留因子pH(a)plglu7FAplglu5plglu3图7-3一个以上的酸或碱基取代的样品分子的保留值对pH值的依赖关系（a）样品：蝶酰基-低聚-υ-L-谷氨酸[-（=FA，叶酸）、三五、七个羟基]与pH值的关系；PartisilODS-2色谱柱；流动相：6%乙腈-缓冲剂（0.1M磷酸盐；450C（b）样品：氨基酸：苯丙氨酸，亮氨酸，颉氨酸，丙氨酸）；XAD-4柱填料；40mM磷酸盐缓冲液。表7-1HPLC中常用缓冲剂缓冲剂pKa缓冲范围aUV截止波长b三氟乙酸21.5~2.5210nm（0.1%）磷酸╱磷酸二氢钾或磷酸氢二钾2.17.212.33.16.2~8.211.3~13.3200nm（0.1%）200nm（10mM）柠檬酸╱柠檬酸三钾3.14.75.42.1~6.4230nm（10mM）甲酸╱甲酸钾3.82.8~4.8210nm（10mM）乙酸╱乙酸钾4.83.8~5.8210nm（10mM）碳酸氢钾╱碳酸钾6.410.35.4~7.4c9.3~11.3200nm（10mM）215nm（10mM）双-Tris丙烷eHCl╱双-Tris丙烷6.89.05.8~7.88.0~10.0215nm（10mM）225nm（10mM）TrisdHCl╱Tris8.37.3~9.3205nm（10mM）氯化铵╱氨9.28.2~10.2200nm（10mM）1-甲基哌啶HCl╱1-甲基10.19.1~11.1215nm（10mM）55哌啶三乙胺HCl╱三乙胺11.010.0~12.0200nm（10mM）a缓冲剂所允许的pH范围（保守的估计）b吸光度0.5A；c需要加入酸（如醋酸或磷酸）dTris：三（羟甲基）氨基甲烷；eBis：1，3-二[三（羧甲基）氨基甲烷]丙烷。缓冲剂的溶解度、挥发性和稳定性（可能与设备、样品和╱或色谱柱发生作用）对某些分离也很重要。无机缓冲剂，如磷酸盐，在含有高浓度有机物的溶液中的溶解度不大。甲醇-水流动相比乙腈-水或THF-水溶液的溶解度大，因此甲醇可能是有机溶剂的首选。无机缓冲剂通常比较稳定，不过挥发性缓冲剂可能难以维持恒定的pH（尤其充氮气时）。例如，碳酸盐缓冲剂放置后，由于长时间CO2会逸出，流动相pH可能增大。pH2.5时，三氟醋酸（TFA）高度解离，几乎不挥发（该缓冲剂经常用于肽和蛋白质的分离；见11-2-1节）。一些缓冲剂放置即降解，储存或长期使用后，其UV吸收也会增加（如：TFA、三乙胺）。有报道，枸橼酸缓冲剂对不锈钢材质有腐蚀作用，但也有报道称每天结束工作时清洗系统、除去枸橼酸盐，HPLC系统即可用该缓冲剂。枸橼酸盐缓冲剂的主要缺点是UV吸收较高，使其UV检测限于230nm以上。一些缓冲剂能通过形成离子对，与样品发生作用（如三氟醋酸缓冲剂与阳离子样品；三乙胺与阴离子样品等）。虽然，这种离子对作用并非总不好，但当分离条件偶然改变时，会使色谱图解析变得复杂（见7-3节）。挥发性缓冲剂对2种情况有作用。如需回收纯化的样品组分（制备HPLC，见第13章），通过蒸发或冷冻干燥能方便地除去缓冲剂。碳酸铵、甲酸铵、醋酸铵和三氟醋酸等缓冲剂可作这类应用。某些检测器[如蒸发光散射（见3-3-1节）或质谱（见3-3-4节）]可能需要挥发性缓冲剂。7-2-2-4合适的缓冲液反相HPLC分离一般采用C8或C18键合相硅胶-基质色谱柱，pH范围超出2~8时，这种色谱柱不稳定。因此，缓冲剂应能将pH控制在2~8之间。如缓冲剂可在210nm或以下波长检测，则很理想。表7-1表明，磷酸盐缓冲剂可控制的pH范围在2.1~3.1或6.2~8.2。醋酸盐的缓冲范围是3.8pH5.8，与磷酸盐结合使用时，则能较好地控制整个2pH8范围内的pH（注意：用磷酸盐缓冲剂的pH6.2~8.2和11.3~13.3的缓冲范围时，硅胶基质柱不稳定；见5-2-3-4节和5-4-3-6节）。枸橼酸盐的优点是能用单一缓冲剂控制宽范围的pH：2.1pH6.4。该缓冲液有另一优点，如将枸橼酸（A，pH2.5）和枸橼酸三钠（B，pH6.5）2缓冲剂等浓度混合，在该pH范围内，pH值随%B的变化几乎呈线性（详见附录ⅠⅤ）。在方法建立过程中，利用该特点简单地混合pH2.5和pH6.5的缓冲剂，即可方便、快速地得到预期的pH改变。一旦确定了最佳pH后，即可用醋酸盐或（尤其是磷酸盐取代枸橼酸盐，以利于理想的低波长检测。然后应注意，改变缓冲剂可能导致选择性的变化。附录ⅠⅤ提供了配制理想pH的缓冲剂的详细信息。7-2-3pKa与化合物结构的关系优化流动相pH值时，了解各样品组分的近似pKa值是非常重要的。利用该信息可以将流动相的pH值规定于一适用的范围中（例如，pKa±1.5时，谱峰间距的变化受pH的影响；或