培训教材-LCQ Ad&Deca&Fleet-2009.11

TheworldleaderinservingscienceThermoScientificChina-DemoCenter-LCQ液质联用仪培训教材Theworldleaderinservingscience第一章质谱基础知识介绍3什么是LC-MS?-LC:HPLC高效液相色谱-MS:MassSpectrometer质谱aninstrumentthatproducesionsandseparatestheminthegasphaseaccordingtotheirmass-to-chargeratio(m/z)“ThebasisinMS(massspectrometry)istheproductionofions,thataresubsequentlyseparatedorfilteredaccordingtotheirmass-to-charge(m/z)ratioanddetected.Theresultingmassspectrumisaplotofthe(relative)abundanceoftheproducedionsasafunctionofthem/zratio.”Niessen,W.M.A.;VanderGreef,J.,LiquidChromatography–MassSpectrometry:PrinciplesandApplications,1992,MarcelDekker,Inc.,NewYork,p.29.4怎样理解质谱5LC-MS&LC-MSnTime时间Response响应Chromatogram离子流图m/zm/zMSMS-MS6总离子流图和质谱图关系T时间7GenerateIons（产生离子）MoveIons（离子传输）SelectIons（选择离子）DetectIons（检测离子）SampleIn(样品引入)DataOut（数据输出）IonOpticsSystem离子透镜系统质谱简化流程8DetectIons检测离子SheathLiquidSheathGasESINeedleAssemblyHeatedCapillaryTubeLensOctapoleEndcapElectronMultiplierAuxiliaryGasSkimmerRingElectrode+15kVConversionDynodeMechanicalPumpTurboPumpTurboPumpAPCIProbeAssemblyGenerateIons产生离子SelectIons选择离子TransferIons传输离子DesolvateIons去溶剂LCQDeca/Ad结构示意图Theworldleaderinservingscience第二章AtmosphericPressureIonization大气压离子化技术10AtmosphericPressureIonization－大气压下离子化离子源类型:1.ElectrosprayIonization(ESI)电喷雾电离–大多数情况下是液态过程2.APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization)大气压下化学电离–气相过程3.APPI(AtmosphericPressurePhoto-Ionization)大气压下光离子化-气相过程离子源作用:1.Desolvatesampleflowforintroductionintomassspectrometer.去溶剂2.BafflethefirstvacuumregionoftheMSfromatmosphericpressureinthesource.真空过渡3.Ionizetheanalyteortransportioninsolutiontothegasphase.离子化4.Pumpawayneutralsandoppositechargedionswhichwouldotherwiseinterferewiththeanalysisofthedesiredpolarity.去除干扰离子产生(API)11ChemistryConsiderations化学考虑ESI:•离子在液态产生•有益于热不稳定化合物的分析•有益于中等到高极性化合物分析•有益于大分子（蛋白/多肽）APCI/APPI:•离子在气态产生•不利于热不稳定化合物的分析•有益于低极性到中等极性化合物分析•适合小分子(steroids-类固醇，甾体化合物)•适合含有发色基团的化合物(APPI)12PolarESIMolecularWeight200,00015,0001,000NonPolarAPCIGC各种离子化技术应用覆盖分析物极性由低到高13IonTransferTube金属毛细管ESINeedle+/-5kVTaylorCone泰勒锥SolventevaporationandIondesolvation溶剂蒸发和去溶剂电喷雾电离过程14ESI喷嘴剖面AuxiliaryGas辅助气SheathGas鞘气Nozzle喷嘴Needle喷针SprayPlume喷雾束±5kV15碱性分子[M+H]+(-NH2)酸性分子[M-H]-(-COOH,-OH)正负离子扫描选择练习：请为这两个化合物选择合适的扫描方式16AtmosphericPressureChemicalIonization(APCI)大气压下化学电离©2004Dr.PaulGates,UniversityofBristol17AtmosphericPressurePhoto-Ionization(APPI)大气压下光离子化电离利用APCI探针去溶剂通过UV光源离子化电离过程有以下两步1.分析物分子与UV光源作用（氪灯产生10和10.6ev光子）。如果分析物的电离势能低于光子能量hv，分析物分子M被电离成分子离子M+。M+hv→M++e-2.分析物离子有可能从质子溶剂（如果存在）那得到质子形成离子[M+H]+。M++S→[M+H]++[S-H]18IonMaxSource离子源室可互换的离子源探针(图中所示是ESI探针)APPI入口光源离子源探针位置调节器19IonMax离子源离子传输毛细管－离子传输毛细管入口－电喷雾喷针－ESI喷嘴－ESI探针电喷雾针离子传输毛细管ESI喷嘴ESI探针20IonMax源设计:ESI探针ESI探针特征：•固定的喷射角度（60度）•增加鞘液接口（精确质量测定和柱后修饰应用）•X,Y,Z方向调节更加便于优化液相入口鞘液入口ESI喷针21样品管外壁聚酰亚胺涂层会吸收某些溶剂而变长样品管截面要平齐以保证好的喷雾状态样品管缩进ESI喷针里1mm处得到最好喷雾效果鞘气ESINeedleESINeedle样品聚酰亚胺聚酰亚胺石英管石英管ESI喷针ESINeedleESINeedle样品聚酰亚胺聚酰亚胺石英管石英管ESI喷针ESI喷针鞘气鞘气鞘气ESI喷针样品管延长22石英毛细管吸收溶剂溶胀图示23ESI探头切面图喷嘴ESI喷针熔融石英毛细管喷嘴ESI喷针金属针~1mm~1mm24MetalNeedleKitStainlessSteelNeedleSizeTypeSolventFlowRate(mL/min)PartNo34-Gauge(30mMID)Lowflow0.5-1070111-6208032-Gauge(50mMID)Highflow5-40070111-6201325液体流速Rate(mL/min)离子传输管或金属毛细管(ºC)*鞘气压力(arb)辅助气压力(arb)SprayVoltage喷雾电压(V)5.024050+3500(-3000**)200350355+4000(-3500**)10004007520+4500(-4000**)•当你改变离子传输毛细管（或金属毛细管）的温度时一定要优化透镜电压**负离子模式“IonMax”ESI源操作条件1arb≈0.3L/Min26APCI探针27IonMax离子源设计:APCI探针离子传输毛细管APCI探针电晕针离子传输毛细管离子源接口28IonMax离子源设计:APCI探头APCI探头特征:•可移动喷雾器•新陶瓷加热器•自我清洁功能内表面温度超过1000ºC•外置热电偶•源室没有塑料材料•喷嘴组件易于更换•X,Y,Z三维可调液相入口陶瓷气化器气化器电源接头29APCI操作注意事项确保APCI探针的蒸发温度足够大，喷雾区域没有液滴沉降蒸发温度：400-450C（针对流速为400-1000uL/min)可以适当降低金属毛细管的温度仔细检查鞘气流速辅助气流量可以先设到0进高浓度的样品可能会导致污染和记忆效应定期加热离子源（自动清洗）30APCISummary分析物性质:*低到中等极性*高质子亲和力*高气相酸度*1200da典型流速:0.2-2.0ml/min比ESI更能容忍缓冲盐仅产生单电荷离子！！！软电离技术典型应用：药物，农药，类固醇及含氮染料31ESI和APCI图谱对比32ESI和APCI图谱对比33PAHsAPPI质谱图Theworldleaderinservingscience第三章LCQ系列35LCQ离子阱质谱系列ClassicDuoDeca36•400um金属毛细管•2个八级杆作为离子传输•一个机械泵•500um金属毛细管•方形四级杆•两个机械泵LCQDUOLCQDECADeca:比Duo大约信号高十倍DUO/DECA比较37Plus下一代LCQ系列–Advantage/DecaXP38•450um金属毛细管•直角探针•一个机械泵•550um金属毛细管•直角探针•两个机械泵XP:比Advantage的信号强度大约高10倍PlusAdvantage/XP比较39LCQ系列更新AdvantageMaxDecaXPPlusMaxNew！LCQFleet！Theworldleaderinservingscience第四章LC-MS考虑因素41Sampleconcentration样品浓度Choiceofcolumnandsolvents柱子型号和溶剂Flowratesandtheireffects流速及影响LC/MS条件优化42样品信息你需要得到尽可能多的样品信息！目标分析物的信息包括以下–分子式,结构(官能团)–分子量–溶解性,pKa–稳定性,储存–是否有标准品–浓度水平和范围基质信息:–类型,状态(液体,固体)–溶解性–不同成份43样品预处理–提高灵敏度去除基质干扰–离子抑制建立去除基质干扰的方法(SPE,萃取,过滤等)进样浓度–与进样量和柱内径有关44不同型号LC色谱柱（标准粒径5.0mm）的最佳使用流速FlowRateColumnI.D.1.0mL/min4.6mm0.5mL/min3.0mm0.2mL/min2.1mm50mL/min1.0mm10mL/minCapillary45柱内径mm1.010005002005015202.03.04.62.0流速mL/min分离效果使用窄内径的柱子可以提高分离效果46LC添加剂酸不要使用无机酸(可能会导致腐蚀)推荐使用醋酸和甲酸碱不要使用碱金属碱(可能会导致腐蚀)推荐使用氢氧化铵和氨水表面活性剂清洁剂和其他表面活性剂会产生离子抑制三氟醋酸(TFA)可以提高液相的分离度，但是在质谱正负离子模式下会产生离子抑制作用三乙胺/三甲胺(TEA/TMA)有助于形成负离子47流动相组成对ESI-MS正离子响应的影响48增加TFA用量对一级质谱信号的影响(50:50ACN:H2O)0.000.050.100.150.200.250.30020406080100%ofControlResponse%TFAResultsarethemeanof2experiments.*Note:TheresultsfromthenoTFAsampleswerevariableduetothelackofpeptideprotonization.Controlsampl