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现代微生物检测技术09级基地二班冯俊霞邹梓姣李梅香龙文英刘芬芳杨成志主要内容认识微生物微生物污染常用微生物检测技术新型微生物检测技术微生物检测的应用及实例认识微生物•微生物：形体微小，结构简单的低等生物的统称。包括病毒、细菌、放线菌、真菌···特点：种类多分布广繁殖快适应性强易变异药品食品环境······食品•据世界卫生组织估计，全世界每年有数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于各种致病性微生物污染导致的。•我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30%～90%，中毒人数占食物中毒总人数的60%～90%。药品•据报道,1970年7月至1971年3月,美国25家医院由于输注了细菌污染的葡萄糖致使378个患者得败血症,40人死亡。•我国也在1991至1993年因人血白蛋白污染,输注发生了46例感染事件,死亡8例。环境肺结核、百日咳、流行性感冒等疾病的传播空气污染沙门氏杆菌病霍乱胃肠道疾病水体污染其他污染土壤化妆品航空燃料······如何及时、有效的检出微生物？常用的微生物检测技术1.常规的检测方法平板分离、镜检、生化试验等2.免疫学方法免疫荧光标记酶联免疫吸附实验（ELISA)自动酶标免疫检测仪3.分子生物学方法核酸探针PCR技术基因芯片技术4.联合检测方法:PCR-ELISA、IMS-PCR等。5.物理学方法电阻抗技术、微热量计技术、放射测量技术生物传感器样品的采集样品的处理（分离、筛选）检验结果报告常规的微生物检测流程酶联免疫吸附试验(ELISA）底物显色定性或定量的分析原理:包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234缺点：该技术的操作技巧性较强交叉反应比较严重、假阳性多该法检测限较高优点：灵敏、特异、快速、稳定以及易于自动化操作PCR技术PCR技术在微生物检测上的原理：利用某一特定微生物特有的基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。若有条带，则说明待测样品中含有目的菌，且目的菌的含量与条带的亮度呈正相关；若无条带，则说明待测样品中无目的菌。缺点：食品中某些物质会干扰Taq聚合酶的作用。只能检测微生物的存在，微生物产生的毒素则不能检测出来假阳性或假阴性结果的出现。优点：特异性强灵敏度高速度快简便、高效PCR技术以其自身这些优势作为食源性致病微生物检测的关健技术在食品中得到广泛的应用准确、高灵敏度自动化检测快速检测操作简单改进质量难控费时费力易发生主观片面错误过程繁琐传统方法新型方法新型微生物检测技术胶体金免疫层析检测条技术微生物实时荧光光电检测技术环介导等温扩增技术（不讲）ATP荧光法快速检测技术胶体金免疫层析检测条技术衬板样品垫金标垫吸收垫NC膜胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，由于静电相斥作用而成为稳定的胶体状态，胶体金颗粒对蛋白有很强的吸附作用。以乙肝病毒的检测为例固定特异性抗体（乙肝表面抗体）乙肝表面抗原与胶体金结合胶体金标记复合物常见的胶体金免疫层析检测条大肠杆菌O157李斯特氏菌沙门氏菌特点：定性检测死菌和活菌、病毒，相对ELISA来说结果直观、准确、快速，且无需专门的检测仪器。该法被认为是微生物和传染病诊断技术标准化最有前途的新技术之一。原理：•根据萤火虫发光原理，在有氧的条件下，虫光素酶催化D-荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：•ATP＋D-荧光素＋O2————AMP＋氧化荧光素＋PPi＋CO2＋荧光Mg2+虫光素酶ATP荧光法快速检测虫光素酶D—荧光素ATP的数量↑•在均过量的情况下：荧光强度↑测量相对荧光值微生物总数量那么常见的荧光检测仪ATP荧光法检测微生物特点：可实现精准、稳定、快速检测微生物总数的需求，但设备比较昂贵，对仪器的清洗保养要求特别高。检测时需做预处理，去除胞外游离ATP。保温2天，检测30分钟单个样品检测（5min)96个样品检测检测仪器可同时放32个检测管、同温检测一次性检测管基于Windows系统的分析软件一台计算机可控制32台检测仪、软件自动将仪器中收集到的数据换算成CFU浓度，对不合格样本提出预警计算机以不同形式的报告进行自动存档和处理Biolumix微生物实时荧光光电检测系统一次性检测管黄色和蓝色两种LED灯检测区荧光管过滤膜孵育区CO2传感器两个基本技术：1.膜技术2.CO2传感器可将样本和微生物所在的孵育区与检测区分开，保持检测区的清澈，同步检测到颜色和荧光的变化，具有重要的防干扰能力。通过在一次性检测管底部嵌入一个透明的CO2固体传感器来检测微生物生长过程中所释放的CO2。当有CO2进入时传感器会变色。只有气体可以穿透这个传感器，而液体、微生物和固体颗粒不能通过，从而避免了其它因素的干扰。微生物检测技术的应用及其实例医学检测食品检测环境检测Clicktoaddtitleinhere4123主要用于：一、医学检测体外培养鉴定药敏试验合理用药提倡联合用药,反对乱、滥用抗生素,警惕人群中耐药菌株的增加体外培养药敏试验常见的微生物感染疾病：已有固定的检查方法不确诊的微生物感染疾病：传统经典方法和现代微生物技术进行鉴定鉴定扩散法稀释法E试验联合药物敏感试验青霉素类头孢菌素类β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂糖肽类······选择药敏试验抗菌药物药敏试验扩散法原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性。药敏结果（抑菌圈直径、MIC值和IC值等）参照NCCLS标准判断结果：敏感：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后的所达到的血药浓度所抑制或杀灭。中介：指测试菌对常规剂量用药后体液或组织中的药物浓度的反应性低于敏感株，但在测定药物浓集部位的体液（如尿液）或使用高于正常给药量（如β-内酰胺类）临床上使用有效。耐药：指测试菌不能被在体内感染部位能达到的抗菌药物浓度所抑制。超级细菌•超级细菌2009年首先发现于印度新德里,该细菌携带NDM-1基因，几乎对所有抗生素具有抗性。因此,超级细菌的出现为人类抗生素的滥用敲响了警钟。•目前检测超级细菌主要用基于PCR基础的检测方法超级细菌NDM-1基因。•如环介导等温扩增法可以在恒温下1h内将核酸扩增到109拷贝,具有操作简单、快速、特异性强等特点。二：食品检测常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数•致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等1.常规标准检测方法（以沙门氏菌为例）食品样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。加工食品均应经过前增菌选择性增菌选择性平板分离生物化学筛选血清学技术鉴定前增菌此培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大多数其他细菌的增殖。未经加工的食品不必经过前增菌而直接增菌。采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。排除大多数非沙门氏菌，也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.4-2003冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃一般4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL＋MM（或TTB）100mL检样匀液25mL＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸H2S＋靛－尿－KCN－赖＋（或一项不符）沙门氏菌血清学试验甘露醇+山梨醇+H2S＋靛＋尿－KCN－赖＋H2S－靛－尿－KCN－赖＋/－非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验ONPG－沙门氏菌非沙门氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h谢谢观赏WPSOfficeMakePresentationmuchmorefun@WPS官方微博@kingsoftwps