搜索
@100biotech.com分子生物学实验指导基础实验实验二十五核糖核酸的测定【实验目的】1．掌握RNA的测定原理2．掌握RNA定量技术【实验原理】RNA分子中的核糖在浓酸中加热，脱水转变成糖醛，后者在氯化铁存在下，与地衣酚试剂（3，5-二羟基甲苯）反应，缩合成绿色化合物，在670nm处有最大吸收峰，从而可进行定量测定。待测样品中的RNA浓度在20～200µg/mL之间时，其吸光度与浓度成正比。反应式如下：核糖糖醛绿色化合物【实验内容与方法】1．取中试管3支，按表2-17操作表2-17RNA的测定方法试剂（mL）标准管标本管空白管RNA标准液1.0RNA提取液1.0蒸馏水1.0地衣酚试剂3.03.03.02．混匀各管，置于沸水浴中加热10min，取出冷却，以空白管调零点，在670nm波长处比色，读取各管的吸光度。3．计算@100biotech.com肝组织标准标本ggRNAODOD/6.04100【实验准备】1．RNA标准液准确称取RNA用0.001mol/LNaOH配制成100mg/mL的溶液。2．地衣酚试剂称取地衣酚（3，5-二羟基甲苯）100mg，溶于100mL浓盐酸（AR）中，再加入100mgFeCl3.6H2O。应用前新鲜配制。3．仪器：紫外可见分光光度计、试管、刻度吸管（孔峰张孟业）实验二十六脱氧核糖核酸提取【实验目的】掌握DNA分离纯化的原理和方法【实验原理】见RNA提取。【实验内容与方法】1．肝匀浆制备与RNA分离，见RNA的提取。2．于含有DNP的沉淀中加入二倍体积的1mol/LNaCl溶液搅拌均匀，室温放置5～6h，以充分提取DNP。3．去除蛋白质将放置完毕的DNP混悬液离心3000rpm/10min，上层转移至另一试管中，加入等体积氯仿-异戊醇混合液，用玻璃纸堵住管口振摇2min，离心3000rpm/10min，此时管中液体分为三层，下层为氯仿，中层为变性的蛋白质，上层为含有DNA的水溶液，将上层转移至另一小试管中（中、下层弃去），加二倍体积冰冷的95%乙醇，边加边摇匀，此时可见有白色纤维状DNA（或为乳白色紊状沉淀），离心3000rpm/5min，弃去上层乙醇溶液，沉淀即为DNA的粗制品。【实验准备】1．1.0mol/LNaCl溶液2．仪器：高速组织捣碎机、离心机、紫外可见分光光度计【注意事项】@100biotech.com(1)在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行，并尽快加入0.14mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶，防止DNA的分解以提高核酸得量。(2)各步骤操作应力求准确，尽量减少中途核酸的丢失，保证定量测定的准确性。（孔峰张孟业）实验二十七脱氧核糖核酸的测定【实验目的】1．掌握DNA的比色测定原理2．掌握DNA定量技术【实验原理】DNA分子在酸性溶液中加热水解后，其脱氧核糖部分可被浓酸缩水成ω-羟基γ-酮基戊醛等化合物，再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收峰。从而可进行定量测定。待测样品中的DNA浓度在20～200µg/mL之间时，其吸光度与浓度成比。反应式如下：脱氧核糖ω-羟基-γ-酮基戊醛【实验内容与方法】1．取中试管3支，编号，按表2-18操作表2-18DNA的测定方法试剂（mL）标准管标本管空白管DNA标准液1.0DNA提取液1.0蒸馏水1.0二苯胺试剂2.02.02.02．混匀各管，置于沸水浴中加热10min，取出冷却，以空白管调零点，在595nm处比色，读取各管的吸光度。3．计算：@100biotech.com肝组织标本标准ggDNAODOD/6.01400【实验准备】1．DNA标准液准确称取DNA用0.01mol/LNaOH配制成400µg/mL溶液。2．二苯胺试剂称取二苯胺1.5g（如不纯，须用70%乙醇重结晶两次），溶于100mL冰醋酸（AR）中，再加入浓硫酸1.5mL，贮存在棕色瓶中放入冰箱内保存备用。3．仪器：紫外可见分光光度计，试管，刻度吸管。【思考题】1．本实验中，测定RNA和DNA含量的原理是什么？2．核酸在细胞质和细胞核中的分布有何特点？（孔峰张孟业）实验二十八真核细胞DNA的制备与定量【实验目的】掌握真核生物细胞基因组DNA制备和定量的基本方法。【实验原理】制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性。一般真核细胞基因组DNA有107～109bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取。在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而获得DNA，DNA经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:①防止和抑制DNase对DNA的降解;②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。【实验内容与方法】1．细胞处理(1)收集对数生长期的培养细胞约5×106于1.5mL离心管中，离心1000rpm/5min，弃上清液。(2)加0.01mol/L的PBS(pH7.2)缓冲液1mL重悬细胞，离心1000rpm/5min，弃上清液。@100biotech.com(3)于振荡器上打散细胞，加500μL裂解缓冲液，充分混匀后置于50℃～55℃水浴1～2h。2．DNA提取(1)加等体积Tris饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分地混匀，4℃离心12000rpm/5min。(2)小心吸取上层水相到另一1.5mL离心管中，加等体积酚/氯仿，轻轻混匀,4℃离心12000rpm/5min。(3)取上层水相到另一1.5mL离心管中，加等体积氯仿/异戊醇，轻轻混匀,4℃离心12000rpm/5min。(4)转移上层水相到另一1.5mL离心管中，加1/10体积的3mol/L醋酸纳(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻颠倒混匀。(5)待絮状物出现后,4℃离心12000rpm/5min。(6)弃上清液，沉淀用75％乙醇洗涤，离心12000rpm/2min。(7)弃上清液，室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明时加50～100μlTE置4℃冰箱溶解过夜。3．DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280m处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230m处。因此，可以在260nm波长处测定DNA吸光度，OD260值为1时约相当于50μg/ml的双链DNA。取1µl所得DNA，加49µl双蒸水，于260nm处测定其吸光值。4．结果分析：根据OD260值可计算出DNA样品的浓度:DNA(mg/ml)=50×OD260×稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高，说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。【实验准备】1.TE缓冲液10mmol/LTris-HCl(pH7.8)、lmmol/LEDTA(pH8.0)2.0.01mol/L的PBS(pH7.2)缓冲液3.裂解缓冲液10mmol/LTris-HCl(pH8.0),15mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA(pH8.0),1%SDS。使用前加入蛋白酶K至100μg/ml。4.Tris饱和酚(pH8.0)5.酚/氯仿(1/1)6.氯仿/异戊醇（24/1）7.无水乙醇、75%乙醇【注意事项】1.所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶。2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性。【思考题】1．制备真核生物细胞基因组DNA时需注意什么？2．如何检测DNA？（孔峰田克立）@100biotech.com实验二十九质粒DNA的提取与定量【实验目的】掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。【实验原理】分离质粒DNA的方法是依据其与染色体DNA分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭环状结构的特点来进行。目前常用的提取质粒的方法有碱裂解法、煮沸法和去污剂法等。本实验采用的是碱裂解法。其原理是将细菌菌膜破裂后，利用质粒DNA与染色体DNA之间变性与复性的差异而达到分离的目的，因为①染色体DNA分子量比质粒DNA大得多；②从细胞中提取到的染色体DNA大多断裂成线状分子,而质粒DNA则为共价闭合环状结构。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性,同时由于受到机械切力或核酸酶等的作用,染色体DNA易被切成大小不同的片段；而闭环质粒DNA链氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，不易发生变性。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA又恢复其天然构象,以可溶状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的不溶性网状结构，与不稳定的大分子RNA、变性的蛋白质-SDS复合物以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。再进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，然后用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒DMA。【实验内容与方法】1．操作流程：挑取单菌落接种到含amp的LB液体培养基管内（3.5ml/管）↓放37℃培养箱内振荡培养过夜将菌液倒入1.5ml离心管中(尽量倒满)12000rpm/30s(沉淀菌体)↓在原管中重复上述操作1次弃上清扣干,加入预冷的solutionⅠ100μL,剧烈振荡打散菌体,冰浴5min↓（以下操作要轻柔）加入新配制的solutionⅡ200μL,温和颠倒离心管2～3次混匀，室温放置5min↓（此时液体应由混浊变为透明粘稠）加入预冷的solutionⅢ150μL,温和颠倒离心管2～3次混匀，冰浴5min↓离心12000rpm/5min小心将含有质粒DNA的上清移至另一离心管中↓加等体积氯仿,轻微振荡，离心12000rpm/2min↓转移上清液至另一离心管加入2倍体积冰冷无水乙醇,轻轻混匀室温放置2分钟↓离心12000rpm/5min弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀，离心12000rpm/2min，弃上清↓重复洗涤1次弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干@100biotech.com↓室温放置15min干燥加入1×TE30μL溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等。【实验准备】1.氨苄青霉素(amp)将amp配制成200μg/μl溶液,分装小管，-20℃保存。2.LB液体培养基取胰蛋白胨2g,酵母提取物1g,氯化钠1g,加水160ml溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0,定容至200ml，高压灭菌。临用前加200μg/μl的amp60μl（每mlLB含amp60μg）。3.固体培养基取胰蛋白胨2g,酵母提取物1g,氯化钠1g,琼脂粉3g,加水160ml溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0,定容至200ml，高压灭菌。临用前加200μg/μlamp60μl，将固体培养基倒入平皿中,待凝固后备用。4.SolutionⅠ取蔗糖17.13g、Tris3.03g、EDTA3.72g，加双蒸水定容至500mL后8磅/英寸2高压灭菌，或过滤除菌，4℃贮存。5.SolutionⅡ0.2mol/L氢氧化钠，1%SDS，临用前新鲜配制。注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。6.SolutionⅢ5mol/LKAc60mL,冰醋酸11.5ml,加双蒸水定容至100ml,高压灭菌，4℃贮存。【注意事项】1．质粒DNA提取过程中动作要轻柔，以免对DNA造成损伤；2．加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体；3．加入solut