37时间分辨光谱学

实验三：时间分辨光谱学摘要在这一实验中你将直接监控溶液分子和这些分子转动中的电子能量转移。除了采用稳态荧光光谱外，纳米时间分辨荧光测量法也将用来完成这些实验。实验目的：1.测定溶液中含给予体和接受体的染料分子溶液的荧光淬火，并与福斯特能量转换理论作比较。这一过程通常称之为FRET2.用时间分辨测量法监控溶液中重定位分子的运动。这种方法适用于用斯托克斯－爱因斯坦－德拜理论测定染料分子的有效分子体积。3.使用你自己装配的虚拟科学仪器4.用商业的数学软件包发展自己的数据分析程序注意：在激光实验前，对实验方法要有所了解，对大量数据要进行分析。昀基本的要求是在开始本实验前要阅读本文，理解材料内容。此外还需要事先阅读推荐参考文献。Ⅰ.背景A．时间分辨法介绍多年来，对于化学过程，特别是化学反应速率一直是研究领域中活跃的区域。注意：这些材料描述的实验具有潜在的危险性。需要高水平的安全训练，特殊的仪器设备，以及适当的人监督。你承担所有的责任、义务、以及执行这些安全程序措施带来的风险。MIT（麻省理工学院）将不承担材料中所介绍内容的带来的责任、义务及风险麻省理工学院化学学院5.33高等化学实验2003下学期设想一个简单的分解反应：BkA⎯→⎯。速率k可以简单地通过测定A的消耗量（或B的生成量）来求得。，根据测定体系中A（或B）含量所花的时间可测定反应昀大速率。举例来说，你无法用一个耗时15秒才能测定A含量的仪器来测量1000s-1的衰退速率。这样的仪器只能测出15秒之后的A物质的量。考虑一个更物理化的例子。这一例子与我们要做的实验有关。大家应该熟悉edgerton教授的摄影。他拍摄了高速运动物体的清晰照片，如子弹穿过香蕉等。（如果不清楚，在麻省理工的博物馆中有几幅照片，一定要去看看）当你感兴趣的事情发生时，利用闪光灯，使胶卷在非常短的时间内曝光，就能得到这样的照片。如果想得到1mm的分辨率，闪光灯的时间就必须小于子弹飞出1mm的时间。否则图像就会变得模糊。在这一实验中，我们将测量能量从一个激发的染料分子（给予体）跃迁到另一个分子（接受体）的速度。这一过程仅仅只需要500皮秒（ps=10-12s）。用激光脉冲激发分子，再采用快速荧光检测器测定能量转移的速率。从前面的讨论中我们可以知道，脉冲的周期必须小于几百皮秒，检测器也必须具备相应的速度。B．溶液中染料分子的电子光谱学染料分子吸收可见光及紫外线导致∗→ππ跃迁至第一电子激发态，S1。这一跃迁的能量是104～105cm-1*(*单位cm-1或波数，用于取代焦耳。波数是光的波长的倒数。与能量转换的关系表现为方程λ/hcE=)电子激发的过程（如图1中的a）非常快（小于10－15秒或一皮秒），以致于核在这一过程中并没有改变位置。因为新的电子结构会引起新的平衡核结构，所以激发还伴随着振动激发。振动驰豫和新的激发态溶质分子的重组会消耗了多余的能量。这些无辐射的驰豫过程会迅速平衡激发态（～10-13－10-12s，或0.1－1皮秒），大约会耗费能量102－103cm-1（热能）这一过程在图一中表示为b。一旦体系处于激发态的势能昀小点，它将通过释放大量能量返回基态，能量值大于104cm-1。由于基态和激发单重态之间具有较大的能量差异，所以能量不容易以热能这种无辐射形式消耗掉。昀可能的驰豫机制是通过荧光，通过荧光，被激发的分子发射一种光场（c）。部分激发态分子通过荧光返回基态（与其他途径相反）的荧光量子产率，φD。用荧光法测量弛豫的时间——荧光的寿命——通常比初始时间大得多（10-10～10-8s，0.1～1ns）。由于振动弛豫过程在激发之后，而且也由于激发态的原子核的位移，荧光的发射波长通常大于吸收。溶液中观测到的吸收和荧光光谱表现出典型的镜像对称性，并且光谱峰出现分离，2λ，被称之为斯托克斯位移。图一：溶液中染色分子的电子态。吸收光（a）导致电子跃迁至第一激发态。这一跃迁伴随着快速驰豫（b）至一新的扩张的电子核结构。发出荧光后（c）系统回到基态。荧光频率低于吸收频率。它表示吸收过程中通过振动弛豫消耗掉的能量值。荧光光谱法是一种用来探察电子结构及电子激发态动力学的方法。对气相分子，荧光光谱（荧光强度作为频率函数）与分子的量子力学电子结构有关。在溶液中，光谱不具备特征性，但荧光是测量电子激发态动力学的有力工具（含时行为）。荧光的强度If与激发态分子数量N成正比。N的数值随着分子返回激发态而改变：)()(tNtIf∝（1）因此通过观察样品发射的随时间变化（通常只有几纳秒）的荧光强度可以直接测量弛豫速率。激发态的一阶弛豫速率方程为：（2）可知荧光强度随着荧光衰减速率Kf呈指数下降)exp()(0tkItIf−=（3）τf＝1/kf指的是荧光强度减至（1/e）I0时的荧光寿命需。图2是一个时间分辨荧光衰减的例子。Ⅱ实验A.用于瞬态和稳态测量的荧光计助教（TA）能帮助你熟悉光学设备，指示你如何使用示波器和电脑来获取数据。荧光计由一个激发臂和一个检测臂组成。激发臂发出激励光激发给予体分子，检测臂检测样品发出的荧光。所有的荧光测量都由4－470室的激光激发源来完成，如图4所示。激发光束为一小Nd：YAG（NeodymiumdopedYittrium图2：时间分辨荧光衰减AluminumGarnet）激光，产生的脉冲光大约为600ps长，波长为532nm。激光每隔200us发射出脉冲光（5Hkz的重复率）。当此光聚焦在样品之前，有一个起偏器垂直地对光偏振。在与激发光垂直90度的方向收集样品发射的荧光。测量臂中的起偏器允许平行（‖）或垂直（⊥）的偏振荧光通过。透镜将荧光映射在检测器上，滤波器把剩余的激发光或不需要的荧光频率屏蔽掉。瞬时荧光测量法所用的检测器是一个快速光电二极管，时间分辨率大约为500ps。它能测量给定时间间隔内样品发出的荧光强度。时间分辨率为400ps的示波器可测量光电二极管中的信号。示波器的轨迹由激光头发出的脉冲发射。这一设备所有的时间分辨率是由脉冲长度、检测器速度、示波器速度决定，大约为√（6002+5002+4002）ps≈870ps。实践中，你可以通过把少量的激发光发射入检测器直接测量此值。对于稳态激光光谱测量法，荧光被聚焦在分光计的狭缝处。分光计里的光栅把荧光发散，进入阵列检测器，检测器能看到样品发射的从可见到近红外范围的所有的荧光光谱。对每一检测器，把检测头(head)大致放在荧光聚焦处，然后使用千分尺调节检测器的位置，使信号昀大化。检测器的响应处于平直的顶部说明检测器达到饱和，应该减小激发强度或插入中性密度滤波器以减弱荧光信号。B.激光安全性新实验室正在装备一个高密度固态激光光源。其他的有关激光的一些危险——化学和能源供应——不是本实验所关心的问题。然而，这种细小激光源发出的光对于进入激光使用中的实验室的任何人而言仍然具有潜在的、严重和永久性的伤害。这并不是我们惧怕激光的原因，但却是我们重视激光的主要原因。即使只是光束的一部分直接射入眼睛也可能会对眼睛造成无法挽回的伤害。所以，在激光周围工作时，必须具备一些基本常识。做本实验时在储存间必须检查的实验所需的特制激光安全护目镜。这种护目镜有两个不同的滤波器，因为在这房间里有两种不同的颜色图4：用于瞬态和稳态的荧光计示意图或波长的光。激光护目镜上的一个滤波器可以屏蔽激光头发出的、肉眼无法看见的少量红外光——，，另一个滤波器可以屏蔽肉眼明显可见的绿光。因为本实验里使用绿光，而它不能被完全除尽，所以用此镜保护眼睛不受绿光伤害。助教尤其要小心，要保证所有的光束都保持在光学工作台的水平方向（也就是说，当你站着的时候，没有光束会朝向你的双眼）。不要把肉眼与激光束置于同一水平面，所以当你弯腰拾起掉落在地板上的物品时要紧闭双眼。随时随地戴上护目镜。如果严格遵循了这些原则，就能确保受伤害的危险性昀小小。本实验中我们所测定样品荧光是没有危险性的。可以不用取下护目镜，完成本实验（包括把荧光导入检测器和对信号昀优化）。如果你对与激光工作感觉不适，把干扰你工作的细节问题告诉助教，他们将对激光安全问题与你做更详尽的讨论Ⅲ.能量转移A.背景对于一个孤立的处于电子激发态的分子来说，弛豫的机制主要是辐射，即在返回基态的过程中发出的分子荧光。这种辐射机制同样适用于被大量溶剂分子包围着的染料分子的稀溶液。但浓度更大的溶液还存在其它的弛豫途径，如染料分子间相互作用引起的弛豫途径。当分子间距离在10－100Å，一个分子中处于激发态的电子运动能给另一个分子施加一个库仑力，这使得激发从一个分子“跳跃”至另一个分子。设昀初处于激发态的分子为给予体（D），能量跳跃所至的分子为接受体（A）。这一过程，就被称为能量转移，如下所示*号表示电子激发态。因此，给予体返回基态伴随着接受体受激发至激发态，然后荧光接受体昀终也返回基态。对这一过程完整的描述是量子力学（例如，Forster或Cohen－Tannoudji），但是经典模型能够为我们建立这一过程的物理图形提供所需的大多数信息。一个昀简单的描述就是两个弹簧振子（把给予体和接受体当作弹簧连接的物体），这两个振子通过弹簧连接在一起。把其中一个振子从平衡位置移开，会导致第二个振子振动，其振动的速率与连接这两个物体的弹簧的力常数成正比。附录1中描述了更多的细节。导致能量转移的库仑作用是一种偶极－偶极相互作用，它与传送天线和接受天线之间的关系相似。如果两个偶极（或天线）之间的距离为R，相互作用的强度（势能）为1/R3。你可以回顾物理化学书，例如Atkin（见参考文献），或普通物理课本中的偶极－偶极相互作用。福斯特（见参考文献）发展了一种接受体和给予体偶极的能量转移理论，指出从给予体到接受体的能量转移速率与1/R6成正比：τD是孤立的给予体分子的荧光衰减时间。在福斯特理论中的基本物理量是R0，即临界转移距离。如果一个给予体和一个接受体之间的距离为R0，那么处于电子激发态的给予体分子通过荧光弛豫的可能性和其通过能量转移至接受体从而达到弛豫的可能性一样大。公式5表明如果R≈R0，能量转移的速率会迅速的改变，R0通常在10Å到100Å之间。所以，如果已知R0，能量转移速率的测量法可用做分子水平的距离测量（一种分子直尺）。福斯特的R0可由一些实验观测值来计算。fD为给予体的荧光光谱，εA为接受体的吸收光谱，JDA是重叠积分，它表示光谱重叠的程度。这一积分表示，给予体发射和接受体吸收之间必须存在共振才能发生有效的能量转移。v表示以波数为单位（cm-1）的频率。荧光光谱必须标准化到单位面积的，以便fD（v）为cm［＝1/(cm-1)］。吸收光谱必须用十进制的摩尔消光系数表示（liter/molcm=(Mcm)-1）,根据比尔定律A＝εA（v）lC,A是吸光率或光学强度，εA（v）是一定频率下的摩尔消光系数，C是浓度，l是光程长度。n为溶剂的折光指数，N为阿弗加得罗常数。κ2是反映电子偶极相对方向的常数,对于转动速率快于分子能量转移速率的分子来说，κ2值为2/3。φD是给予体荧光量子产率。由于R0的单位是cm，公式6通常也写为：对于溶液中染料分子而言，R0通常为10－100Å，能量转移的速率kD→A（0.1－1ns-1），通常和浓度约为10-3M的接受体溶液的荧光速率相似。在这一界限（10－100Å）内，处于电子激发态的给予体有两种有效的衰减途径：荧光和能量转移至给予体。对于明显分开的给予体和接受体分子而言，荧光和能量转移速率之和可作为呈指数衰减的荧光速率。在溶液中，由于存在给予体－接受体的距离分布，这将就使得问题更加复杂（见下）。正如公式6所示，能量转移昀重要的条件是共振。给予体的荧光光谱代表了激发的给予体偶极的振动频率。它必须和从基态跃迁至激发态的接受体的电子转移频率（也就是吸收光谱）相匹配。重叠积分JDA的大小代表频率匹配的程度。如果激发态给予体和基态接受体之间不存在共振，能量转移就不可能。因此，能量转移机制通常被称为福斯特共振能量转移（或FRET）共振和振动弛豫表明FRET是一个能量下降过程。给予体的荧光频率低于给予体的吸收频率。同样地，一旦能量从给予体转移到接