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蛙的催青和人工授精一、目的要求通过本实验，掌握中国虎纹蛙的催青及人工授精的操作技术，了解蛙从受精卵到变态阶段的外形变化，进一步树立蛙胚发育中动态和立体的概念。二、仪器药品注射器、培养皿、解剖剪、解剖镊子、解剖镜、显微镜、塑料桶、1000ml的广口瓶、吸管、放大镜、采集网。LRH-A3（促黄体）、HCG（商品名：多情素）。三、材料虎纹蛙（Ranatigrinarugulosa）四、方法催青及人工授精1．催青把刚从野外捕捉到的蛙，选择雌蛙体长大于75mm和雄蛙体长大于70mm的性成熟的个体，放于水缸中。首先提高水温达到18—20ºC。取雌蛙，在腹腔注射LRH-A（注射量每只3—5µg左右），hCG(注射量每只20—30国际单位/ml)，雄蛙的注射量可酌减一半。具体配置方法：LRH-A（100μg每支）3支加水配成40ml溶液，雌蛙剂量为0.5ml，雄蛙减半；HCG（每支10000国际单位）1支加水配成500ml溶液，雌蛙剂量1ml，雄蛙减半。将注射后的虎纹蛙分成3桶，A桶10只雄蛙，B桶10只雌蛙，C桶5对雌雄。桶里放少量水，将纸皮箱剪开洞口后盖住桶口，以重物压上，留出透气口的同时防止蛙逃窜。2．人工授精精子悬浮液的制备：先用剪刀将雄蛙腹中线剖开，露出黄色或褐色的精巢，用剪刀剪下精巢，放入培养皿或研钵中。用弯头剪刀将精巢剪碎或用研钵轻轻研磨，再加适量生理盐水，用玻璃棒搅拌均匀，即可制得精子悬浮液。用左手握住催青后即将产卵的雌蛙，腹部向上，用右手拇指和食指由前向后轻轻挤压腹部，卵即可由泄殖孔流出。把挤出的卵，收集在培养缸内，加入已制备好的精子悬浮液摇匀，使精液和卵充分均匀接触，10~15min后更换净水，洗去多余精子，经几次换水后，加入足量清水，以保证受精卵正常发育。（三）胚胎发育的观察取少许卵块，放在滤纸上轻轻滚动，以清除卵外之胶膜，再置于盛有清水的培养皿中，用吸管将需要观察的受精卵，移入另一培养皿中，在解剖镜下，观察各发育时期的外部形态的变化。下表为虎纹蛙正常胚胎发育时期表虎纹蛙（Ranatigrinarugulosa）正常发育时期表发育时间由受精时所需的时间（h）此时期耗时（h）水温（℃）该时期特点备注第一时期受精卵0.63h26.0℃动物极朝上，棕黑色；植物极朝下，乳白色室温为26.0℃第二时期2细胞期0.63h0.13h经裂，卵裂沟贯穿动植物极第三时期4细胞期0.76h0.83h经裂，卵裂沟垂直于第一次第四时期8细胞期1.59h0.08h经裂，两条卵裂沟第五时期16细胞期1.67h0.35h纬裂，动物半球略小于植物半球第六时期32细胞期2.02h0.15h经裂第七时期囊胚早期2.17h0.53h动物半球卵裂速度大于植物半球，卵裂不同不同规则第八时期囊胚中期2.70h0.8h动物极隆起第九时期囊胚晚期3.5h1.58h细胞边界不明显第十时期原肠胚早期5.08h0.97h赤道板上方，偏向动物极的地方，部分细胞内陷及卷入第十一时期原肠胚中期6.05h2.05h下包卵黄达2/3第十二时期原肠胚晚期8.1h1.83h30.7℃卵黄栓出现此时观察地点转移到宿舍，室温为30.7℃，错过神经板期第十三时期神经板期胚孔封闭，胚体纵轴开始伸长，背部变平坦第十四时期神经褶期9.93h2.1h30.5℃神经板从前端两侧开始隆起并向后延伸形成神经褶，中间凹陷形成神经沟纤毛出现期较难判断，故错过第十五时期纤毛出现期(胚胎的转动)两侧神经褶逐渐向中间合拢,神经沟变深而窄，然后成线状裂缝第十六时期神经管期12.03h0.83h29.6℃神经褶完全愈合形成神经管第十七时期尾芽期12.86h11.3h28.9℃尾芽明显翘起并伸长这段时期由于发生在深夜，故错过，孵化指幼体出膜，在下面发育个时期中无图片第十八时期肌肉效应期胚体受机械刺激，躯干及尾会左右扭动第十九时期孵化第二十时期心跳期咽部腹面可见心脏微微搏动第二十一时期鳃血循环期24.16h4.3h28.2℃鳃丝内见血球作间歇性脉冲流动，口窝加深第二十二时期开口期28.46h1.35h30.0℃口窝内的口板膜穿通，口呈裂缝状第二十三时期尾血循环期29.81h10.1h30.1℃尾部与腹部交界之处可见到微弱的血液循环第二十四时期鳃盖褶初期39.91h9.9h30.8℃每侧外鳃基部出现皮肤褶，并逐渐向腹面会合形成一条完整的肤褶第二十五时期右鳃盖闭合期49.81h11.7h29.8℃右侧外鳃丝逐渐缩短，直至被鳃盖褶所遮盖，左侧鳃丝仍大部分暴露第二十六时期鳃盖封闭期61.51h30.9℃左侧外鳃完全被鳃盖褶所封盖从受精卵到鳃盖封闭期总共耗时61.51h。五、虎纹蛙胚胎发育各时期1.受精卵；2.二细胞期；3.四细胞期；4.八细胞期；5.十六细胞期；6.三十二细胞期；7.囊胚早期；8.囊胚中期；9.囊胚晚期；10.原肠胚早期；11.原肠胚中期；12.原肠胚晚期；13.神经板期；14.神经褶期；15.纤毛出现期(胚胎的转动)；16.神经管期；17.尾芽期；18.肌肉效应期；19..心跳期；20.鳃血循环期；21.开口期；22.尾血循环期；23.鳃盖褶初期；24.右鳃盖闭合期25.角质颌期；26.鳃盖封闭期六、讨论：1.在给亲蛙注射催产时，可采用皮下注射法。具体操作是：两人配合，一人抓住青蛙，另一人抓起蛙背部尾椎骨两侧的皮肤，将针头插进皮下，用手指按住注射口，打完后轻轻将催产素推开，以防从伤口溢出。2.由于整个实验过程中分在两个地方进行，在实验室维持在水温26.0℃，而在宿舍则处于29~31℃的波动范围内，整个实验从受精卵发育到鳃盖封闭期共耗时61.51小时，对照刘丽的泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究（1）的时间为泰国虎纹蛙发育时间总计70.4小时，中国虎纹蛙时间总计92.5小时（水温（25±1）℃），而本次实验材料为中国虎纹蛙，证明较高温度能加快虎纹蛙胚胎发育的速度。