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1高纯水系统的微生物控制高纯水系统的微生物控制高纯水系统的微生物控制高纯水系统的微生物控制Dr.BettinaLangeDr.BettinaLangeMicrobiologistMicrobiologist,,HeadHeadofofParenteralsParenteralsBSPBSP--PSPS--PHSCLEVLiquidaPHSCLEVLiquida2内容内容内容内容水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物基本的法规要求基本的法规要求基本的法规要求基本的法规要求微生物学测试方法微生物学测试方法微生物学测试方法微生物学测试方法日常监测程序日常监测程序日常监测程序日常监测程序水系统的确认水系统的确认水系统的确认水系统的确认偏差的处理偏差的处理偏差的处理偏差的处理3水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物医药产品中的水生微生物污染医药产品中的水生微生物污染医药产品中的水生微生物污染医药产品中的水生微生物污染:水在医药产品中被广泛应用作为原材料或成分并且是通用的清洁剂水在医药产品中被广泛应用作为原材料或成分并且是通用的清洁剂水在医药产品中被广泛应用作为原材料或成分并且是通用的清洁剂水在医药产品中被广泛应用作为原材料或成分并且是通用的清洁剂（（（（最最最最终冲洗终冲洗终冲洗终冲洗））））水也是许多微生物理想的培养基水也是许多微生物理想的培养基水也是许多微生物理想的培养基水也是许多微生物理想的培养基。。。。由于水源和贮存方式的不同由于水源和贮存方式的不同由于水源和贮存方式的不同由于水源和贮存方式的不同，，，，微生物微生物微生物微生物或多或少地存在于所有类型的水中或多或少地存在于所有类型的水中或多或少地存在于所有类型的水中或多或少地存在于所有类型的水中!!!典型的水生微生物典型的水生微生物典型的水生微生物典型的水生微生物:主要是革兰氏阴性细菌主要是革兰氏阴性细菌主要是革兰氏阴性细菌主要是革兰氏阴性细菌——假单胞菌科假单胞菌科假单胞菌科假单胞菌科，，，，肠杆菌科肠杆菌科肠杆菌科肠杆菌科，，，，产黄菌属产黄菌属产黄菌属产黄菌属，，，，色素杆色素杆色素杆色素杆菌属菌属菌属菌属，，，，不动杆菌等不动杆菌等不动杆菌等不动杆菌等)指示微生物指示微生物指示微生物指示微生物(控制菌控制菌控制菌控制菌):铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌(指示营养物质水平的提高指示营养物质水平的提高指示营养物质水平的提高指示营养物质水平的提高)大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌(指示粪便污染指示粪便污染指示粪便污染指示粪便污染)4水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物多数水生微生物的典型特征多数水生微生物的典型特征多数水生微生物的典型特征多数水生微生物的典型特征:形成内毒素寡养的(10ng/l葡萄糖的等价物就足够了)对热和干燥敏感对化学消毒剂有强的抵抗力降解药品(代谢方式的高变异性)喜欢有氧环境能运动(铜绿假单胞菌:56μm/s)适应机制适应机制适应机制适应机制:细胞收缩(球形的“饥饿形态”,可达到正常形态的四分之一)更不易被水沾湿（表面定殖）increasedhydrophobicity(colonizationofsurfaces)形成抗性休眠细胞(代谢停止)5水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物生物膜问题生物膜问题生物膜问题生物膜问题微生物总是以自由漂浮的细胞形态或表面定殖的形态存在如：纯水管道的表面可能定殖有104to106CFU/cm2,然而在循环水中只有10CFU/l能被检出生物膜导致了水的持久性污染(“生物污垢”)生物膜的形成有三个不同的阶段(在形成的初期生物膜仍然是可逆的)生物膜的发展主要受三个主要因素的影响:微生物的种类,表面和环境6水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物水系统中的微生物高纯水系统中生物污染的预防高纯水系统中生物污染的预防高纯水系统中生物污染的预防高纯水系统中生物污染的预防优化的水系统的设计(表面粗糙度,焊接结合处,没有长的不流动的支管或不流动的贮存区)永久环流，在非循环区:L/D6可以热消毒(80°C)或采用自清洁式热循环水系统(70°C)UV光(λ=254nm,可以杀灭90-95%的微生物)臭氧(10ppb)化学消毒:过氧乙酸,过氧化氢,氯(生物膜深处的微生物被细胞外聚合物很好地保护)注意:预防生物膜的发展更具合理性，通常比除去已经存在并定殖的微生物更有效也更容易!!!71.关于测试方法及限度的法规要求关于测试方法及限度的法规要求关于测试方法及限度的法规要求关于测试方法及限度的法规要求：：：：药典(Ph.Eur.,USP)各地关于饮用水的法规EMEA/CPMP“关于制药用水质量指导原则的注释”2.指南及指南及指南及指南及“指导性文件指导性文件指导性文件指导性文件”FDAGuidetoInspectionsofHighPurityWaterSystemsWHOGoodManufacturingPractices:WaterforPharmaceuticalUse法规要求法规要求法规要求法规要求8法规要求法规要求法规要求法规要求Ph.Eur.及及及及TVO中对微生物要求中对微生物要求中对微生物要求中对微生物要求：：：：0,25IU/ml--*10CFU/100ml注射用水0,25IU/ml--*10CFU/100ml高纯水(0,25IU/ml,如果用于制造透析液)--*100CFU/ml纯水--大肠埃希菌,大肠菌群,肠球菌在100ml中不得检出100CFU/ml饮用水内毒素指定菌指定菌指定菌指定菌活的总需氧菌数活的总需氧菌数活的总需氧菌数活的总需氧菌数*测试指定微生物是许多公司通常的做法测试指定微生物是许多公司通常的做法测试指定微生物是许多公司通常的做法测试指定微生物是许多公司通常的做法，，，，并且在并且在并且在并且在FDA及及及及WHO指导原则中被指导原则中被指导原则中被指导原则中被推荐进行推荐进行推荐进行推荐进行9法规要求法规要求法规要求法规要求微生物限度的比较和使用微生物限度的比较和使用微生物限度的比较和使用微生物限度的比较和使用:直到微生物浓度达到106CFU/ml时才会呈现肉眼可以识别的浑浊约104CFU/ml(假单胞菌科)以上的细菌浓度才会促使细菌内毒素的形成多数天然来源的水可以检测到大于106CFU/ml的微生物至少106细菌细胞才能产生1μgTOC(1μg/kg=1ppb,注射用水的限度为:500ppb)10用于水系统控制的微生物学试验方法用于水系统控制的微生物学试验方法用于水系统控制的微生物学试验方法用于水系统控制的微生物学试验方法传统培养试验方法的原理传统培养试验方法的原理传统培养试验方法的原理传统培养试验方法的原理:基于微生物从水样中至培养基中的转移(液体或固体)膜过滤法(过滤膜的孔径不得大于0.45μ)或倒平板法→琼脂培养基双倍浓度的液体培养基稀释法→液体培养基培养:如对于琼脂培养基在30-35°C培养５天,对于选择性液体培养基在35-37°C培养40小时对长出的菌落进行计数,如需要进行次级培养，菌的鉴别11用于水系统控制的微生物试验方法用于水系统控制的微生物试验方法用于水系统控制的微生物试验方法用于水系统控制的微生物试验方法活的总需氧菌数的测定活的总需氧菌数的测定活的总需氧菌数的测定活的总需氧菌数的测定指示微生物测试指示微生物测试指示微生物测试指示微生物测试液体培养法膜过滤法12用于水系统控制的微生物测试方法用于水系统控制的微生物测试方法用于水系统控制的微生物测试方法用于水系统控制的微生物测试方法水中总的微生物数的测定采用膜过滤法膜过滤法膜过滤法膜过滤法:过滤指定的样品量(纯水2x1ml，注射用水每个样品200ml)过滤单元MBS213用于水系统中微生物控制的微生物学测试方法用于水系统中微生物控制的微生物学测试方法用于水系统中微生物控制的微生物学测试方法用于水系统中微生物控制的微生物学测试方法→培养基培养基培养基培养基:培养基是微生物学家的主要分析设备→培养基的质量至关重要(必须定期对培养基的效力进行测试(促生长试验))测定总的微生物数用:R2A琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基(按照Ph.Eur.):只含有2,8g/l的有机营养物(比CASO的营养物水平减少约90%→是低营养培养基)检测指示微生物用选择性肉汤培养基,如检测铜绿假单胞菌的孔雀绿液体培养基及检测大肠埃希菌的乳糖蛋白胨液体培养基14用于水系统控制的微生物学试验方法用于水系统控制的微生物学试验方法用于水系统控制的微生物学试验方法用于水系统控制的微生物学试验方法分离出的微生物的鉴定分离出的微生物的鉴定分离出的微生物的鉴定分离出的微生物的鉴定水系统中生物样本的认识是控制活动的一个重要部分当超出行动水平时菌种的鉴定给出了一个关于污染根本原因的线索并且使风险评估能够得以进行水系统的分离菌应该按照规定的间隔进行鉴定(按照书面的程序),至少在超出限度时要进行鉴定鉴别的方法:显微特征及肉眼观察的特征描述,革兰氏染色,生化/代谢反应,DNA分析广泛的微生物学专门技术被要求用于进行微生物鉴别15用于水系统控制的微生物学测试方法用于水系统控制的微生物学测试方法用于水系统控制的微生物学测试方法用于水系统控制的微生物学测试方法替代的替代的替代的替代的(快速的快速的快速的快速的)微生物学测试方法微生物学测试方法微生物学测试方法微生物学测试方法如如如如:ATP生物发光法生物发光法生物发光法生物发光法Biolouminescence,荧光法荧光法荧光法荧光法,PCR（（（（聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应））））,DNA探针法探针法探针法探针法,ELISA（（（（酶联免疫反应酶联免疫反应酶联免疫反应酶联免疫反应））））可能替代传统的测试方法主要优势:基于快速分析的快速结果并且可以缩短培养时间应用的前提是验证显示新的方法与传统的方法是等价的缺点:验证所需要的费用/时间,官方的认可,限度的适用性,检出“获得但不可培养的细胞”，通常难以对微生物进行鉴别在药典方法之外增加应用新的方法可能是一种可行的方案16高纯水系统的日常监测程序高纯水系统的日常监测程序高纯水系统的日常监测程序高纯水系统的日常监测程序测试程序的书面要求测试程序的书面要求测试程序的书面要求测试程序的书面要求(SOP)指定取样点，测试频率，取样方法，限度，分析方法，文件常用的测试频率常用的测试频率常用的测试频率常用的测试频率(举例)关键取样点(水被用作制造产品的成分)及次关键点(用于清洁)纯水:每周/每月WFI:每天(回水点),每周/每周两次（bi-weekly)每两周一次取样点的选择取样点的选择取样点的选择取样点的选择,代表性取样点代表性取样点代表性取样点代表性取样点纯水及注射用水WFI:每个“用水点”，循环系统的供水点和回水点，除此之外的备用点furthersitesatthepreparationinstallationifnecessary饮用水:管网中选择的点17高纯水系统的日常监测程序高纯水系统的日常监测程序高纯水系统的日常监测程序高纯水系统的日常监测程序取样程序应该考虑生产中水的使用方式取样程序应该考虑生产中水的使用方式取样程序应该考虑生产中水的使用方式取样程序应该考虑生产中水的使用方式:使用点的取样应该模拟生产过程应该考虑取样阀，软管等的影响取样及样品的处理取样及样品的处理取样及样品的处理取样及样品的处理:避免污染,合适的取样容器,取样后到开始测试之间不应超过两小时限度的设定限度的设定限度的设定限度的设定:定义警报水平及行动水平(不是标准nospecifications!)行动水平不应超出药典的限度警报水平应基于历史数据定期重新确定18高纯水系统的监测高纯水系统的监测高纯水系统的监测高纯水系统的监测结果及趋势的记录取样点必