第3章 发酵工业原料及其处理

发酵工程南阳师范学院生命科学与技术学院发酵工程发酵工程第一章发酵工程总论第二章发酵设备第三章发酵工业原料及其处理第四章发酵工业灭菌第五章发酵菌种的制备第六章发酵工业放大第七章微生物发酵机制第八章发酵动力学第九章发酵过程工艺控制第十章发酵染菌及防治第十一章发酵工业废物、废水处理和资源化技术第十二章展望发酵工程本节课的重点和难点本节课的重点1、发酵培养基成分的确定2、淀粉的双酶法制糖3、淀粉水解糖的原理本节课的难点1、淀粉水解糖的原理2、淀粉的双酶法制糖发酵工程1、发酵营养基质的组成2、工业发酵培养基3、工业发酵中营养基质的配制方法第三章发酵工业原料及其处理发酵工程发酵工业原料选择的标准1、原料中碳的可利用率高；2、发酵产率高，而且尽可能使发酵残余物少；3、原料质量好，成分稳定，污染变质少，易灭菌；4、价廉，来源方便，易于贮存。1.1碳源营养1.2氮源营养1.3无机盐及微量元素1.4生长因子、前体物质、产物促进剂和抑制剂1.5水1发酵营养基质的组成第三章发酵工业原料及其处理1.1碳源：凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，统称为碳源。1）作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2）来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃1发酵营养基质的组成3）工业上常用的碳源①葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标1.1碳源不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大①葡萄糖3）工业上常用的糖类除葡萄糖外，糖类中其他单糖（如果糖）也是很好的碳源。其次是双糖（如蔗糖、麦芽糖、乳糖）和多糖（如淀粉和纤维素），再次是有机酸、醇类、烃类等。②其他糖类淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点：来源广泛、价格低难利用，但可以解除葡萄糖效应③糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响糖蜜使用的注意点除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐④酯类使用条件：微生物必须能利用长链脂肪酸（如各种动物油和植物油）缺点：发酵液要制成乳状液体，发酵罐的结构也要作一定改造。利用脂肪酸做碳源时，要进行β-氧化，要比氧化糖的EMP和TCA途径花费更多的能量，因此，供氧必须保证。⑤烃类使用条件：微生物必须能利用烃类做碳源。优点：石油微生物分布广、种类多；常温常压下进行。例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2李江华，无锡轻工大学学报，2004(半纤维素酶)嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型苏勤，林业化学与工业，20041.2氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。①无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。如：(NH4)2SO4→2NH3+2H2SO4NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH1发酵营养基质的组成无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH①无机氮源毛霉产蛋白酶的研究陈涛，中国酿造，2004初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素②有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等1.2氮源有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。②有机氮源1.2氮源氮源使用的一些相关问题有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题1.2氮源1.3无机盐及微量元素1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点A.对于其他渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑1发酵营养基质的组成例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/mL发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330，生产α-淀粉酶，P对酶活的影响处理pH酶活不加4.25120min加K2HPO45.4530min加KH2PO44.6275min1.4生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。狭义的生长因子一般仅指维生素。①生长因子如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。1发酵营养基质的组成一些维生素生长因子及其生理功能维生素生理功能维生素B1（硫胺素）脱羧酶辅酶，与酮基转移有关维生素B2（核黄素）构成黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸，作为电子传递链中的递H体维生素B3（泛酸）辅酶A（CoA）的前体物质之一，递酰基体，是细胞内多种酶的辅酶维生素B5（烟酸）又称尼克酸，是辅酶I，辅酶II的前体，参与细胞内很多氧化还原反应维生素B6（吡哆醇）其磷酸酯是转氨辅酶，也与氨酸酸消旋和脱羧有关维生素B11（叶酸）构成四氢叶酸，传递各种C1分子维生素B12（钴胺素）变位酶辅酶维生素H（生物素）硫辛酸羧化酶辅酶，在脂肪酸代谢中有重要作用递酰基体，常与CoA、VB1协同作用前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接使微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。②前体青霉素：分子量用寿命356苯乙酸:分子量136四、生长因子、前体和产物促进剂作用：前体有助于提高产量和组份（P55）用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/mL的青霉素G，需要多少苯乙酸青霉素＝6000×0.6（微克）＝36mg/mL苯乙酸＝（3×6136）/356=13.8mg/mL=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：13.8/[(0.337/0.6)×36]=68%②前体1.4生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂用法：前体使用时普遍采用流加的方法。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。Why？前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率。②前体几种常见的前体（p43）产物前体产物前体青霉素G苯乙酸等维生素B12钴化物青霉素O烯丙基-巯基乙酸丝氨酸甘氨酸青霉素V苯氧乙酸色氨酸吲哚、氨茴酸链霉素肌醇、精氨酸等蛋氨酸2-羟基-4-甲基硫代丁酸金霉素氯化物等异亮氨酸D-苏氨酸红霉素丙酸、丙醇等苏氨酸高丝氨酸灰黄霉素氯化物有关前体的研究:马成新,焦鹏.蛭弧菌J26发酵生产维生素C前体产物的鉴定.微生物学杂志,1998,18(3)董函竹,刘沛溢,谭天伟.补加前体L-蛋氨酸对高密度发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸的影响.生物工程学报,2006,22(2)陈珊,贺小贤,潘亚磊.氨基酸前体对酿酒酵母生产谷胱甘肽影响的研究.陕西科技大学学报(自然科学版),2008,26(3)③产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。常用促进剂有各种表面活性剂（洗净剂、吐温-80、植酸等）二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黄血盐、甲醇等。1.4生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。③产物促进剂1.4生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂有些抑制剂可抑制某些合成产物的途径而使代谢向所需产物的途径转化，常常被用在抗生素和有机溶剂发酵中。氯霉素、植酸、草酸等能抑制噬菌体的繁殖，可用于氨基酸发酵。（P44）④抑制剂1.4生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂发酵工业常用的抑制剂（P44）产物被抑制产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸四环素金霉素溴化物、硫脲去甲基金霉素金霉素硫磺化合物、乙硫氨酸头孢菌素C头孢霉素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴必妥药物甘油乙醇亚硫酸盐1.5水对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。1发酵营养基质的组成2.1培养基的类型与功能2.2营养基质的选择2.3培养基的设计与优化2工业发酵培养基第三章发酵工业原料及其处理发酵工程广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。发酵培养基的作用：满足菌体的生长促进产物的形成培养基发酵培养基的要求①培养基能够满足产物最经济的合成。②发酵后所形成的副产物尽可能的少。③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型一、按纯度合成培养基:原料其化学成分明确、稳定适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产天然培养基:采用天然原料原料来源丰富(大多为农副产品)