第4章 食品毒理学实验基础

第4章食品毒理学实验基础Chapter4ExperimentalBasisforFoodToxicology本章内容4.1常用实验动物选择和处理4.1.1常用实验动物特征4.1.2实验动物的选择和处理4.1.3实验动物的染毒和处置4.2食品毒理学试验的设计原则4.2.1体外试验涉及4.2.2体内毒理学试验涉及4.3毒理学试验结果处理和分析4.3.1毒理学试验的数据处理和统计方法4.3.2统计学意义和生物学意义本章学习目的与要求掌握实验动物的选择原则和方法；熟悉实验动物的常规处置、染毒方式、采样和处死方法；了解常用实验动物外貌、生活习性、生长发育和解剖生理特征。掌握食品毒理学实验设计基本原则；熟悉毒理学试验结果处理和分析方法。4.1常用实验动物选择和处理4.1.1常用实验动物特征实验动物(laboratoryanimals)：经人工饲育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检验以及其他科学实验的动物。或者简单说以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。实验动物种类：常用的实验动物物种为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡、青蛙等。★实验动物特点：①具有较小的个体差异，较强敏感性，较好的重复性与较一致的反应性。②一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不明确，健康状况及个体差异较大，反应性不一致，一般不作为实验动物，其所取得的数据不被科学界所公认。4.1.1常用实验动物特征常用实验动物生物学和生理学参数表参数小鼠大鼠豚鼠兔成体体重(kg)0.0350.450.433.7平均寿命(年)1.534~58水消耗(ml/d)635145300饲料消耗(成本g/d)51012180成体代谢(cal／kgd)600130100110体温(℃)37.438.238.639.4呼吸频率(次／min)160(80～240)85(65～110)90(70～100)53(40～65)心率(次／min)600328300200血压mmHg(收缩／舒张)120／75130/9077/50110／80出生体重(g)1.55~675~100100断乳时体重(g)10～1240～50250100～15004.1.1常用实验动物特征常用实验动物生物学和生理学参数表（续）参数小鼠大鼠豚鼠兔开眼(d)1110～12出生当天10妊娠(d)20216731性周期(d)4～54～516～1915～16动情期(d)11130窝数量1～126～91～51～13断乳年龄(周)33～428生殖年龄(月)22～336～7生殖期(年)1131～3生殖季节任何时间任何时间任何时间任何时间所需面积(tf2)*0.40.40.73环境温度(℃)19～2519～2519～2518～28血容量(ML/Kg)80657553凝血时间(s)146060300HCT(％红细胞)41464242Hb(g／bl)16.014.812.413.64.1.2实验动物的选择和处理4.1.2.1实验动物的选择毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。实验动物选择原因：外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种实验动物之间表现不同，物种差别可以表现在量方面，引起毒性的剂量差别，即毒性大小的差别，如有报道，人对138种化学物的敏感性为大鼠的1.8～10.5倍。物种差别也可以表现在质方面(毒性效应的差别)，如除草剂百草枯对人引起肺损伤，而对狗则未见到。4.1.2.1实验动物的选择——选择原则相似性原则：选择结构、功能、代谢、群体分布、疾病状态方面与人类相似的物种。差异性原则：研究过程要求以差异为指标或特殊条件时，选用不同种系实验动物的某些特殊反应，更适合于不同研究目的的要求。例如人类利用不同种属动物对病原微生物的易感性差异来生产弱毒疫苗。易化性原则：进化程度高、结构功能复杂的动物有时会给实验条件控制或实验结果分析带来困难，则应从易化角度入手，选择既能满足实验要求，结构功能又简单，便于实验分析的动物。如反射弧的研究选择两栖动物；遗传学研究选择果蝇。相容或相匹配原则：设计动物实验时，选用的动物质量等级要与实验设计、实验条件、实验者技术、方法、试剂性能相匹配。可获得性原则：在不影响实验质量的前提下，选择最易获得、最经济、易饲养管理的动物。重复性和均一性原则：选用标准化的实验动物。杜绝使用随意交配而来的杂种动物和未经任何微生物控制的非标准化动物。4.1.2.1实验动物的选择——选择方法物种选择物种选择的基本原则选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和实验操作的物种；经济并易于获得的物种。目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗；豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验；兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验；遗传毒理学试验多用小鼠；致癌试验常用大鼠和小鼠；致畸试验常用大鼠、小鼠和兔；迟发性神经毒性试验常用母鸡。品系选择品系(strain)是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。实验动物按遗传学控制分类可分为：①近交系：指同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。一般近交8～12代的近交群没有实用价值，只有连续20代以后，群体基因才能达到纯合和基本稳定。②杂交群动物(杂交1代，F1)，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。③封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。4.1.2.1实验动物的选择——选择方法4.1.2.1实验动物的选择——选择方法实验动物微生物控制的选择按微生物控制分类，实验动物分为四级，如下表。对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用二级(或二级以上)的动物，以保证实验结果的可靠性。实验动物微生物等级级别要求I级普通动物，应没有传染给人的疾病Ⅱ级清洁动物，除I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病Ⅲ级无特定病原体动物(SPF)，除Ⅱ级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体IV级无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫(包括绝大部分病毒)4.1.2.1实验动物的选择——选择方法个体选择实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个体差异，应注意实验动物的个体选择。重点是动物的性别、年龄、体重、生理状态和健康状况。一般来说，对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。急性试验一般选用成年动物；慢性试验因实验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动物，以使实验周期能复盖成年期。实际工作中常以动物的体重粗略地判断动物的年龄。性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕的雌性动物。但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及繁殖试验等，则需有计划地合笼交配。为确保选择健康动物，一般在实验前观察5～7天。4.1.2.1实验动物的选择——选择方法大、小鼠根据形态鉴定日龄（大、小情况基本一样）4.1.2.2实验动物的处理1.健康检疫实验动物在购进之后，应雌雄分开饲养。一般应进行5～7天的检疫，在此期间应多次观察动物，及时剔除不健康的动物。2.实验动物的抓取和固定方法3.性别鉴定4.实验动物的编号和标记方法实验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸(黄色)、品红(红色)的酒精饱和溶液在动物被毛上染色。对啮齿动物还可用剪耳法标记。对狗等大动物一般用挂牌法。5.实验动物被毛去除方法剪毛、拔毛、剃毛、脱毛（如硫化钠或硫化钡）6.实验动物的麻醉4.1.2.2实验动物的处理2.实验动物的抓取和固定方法小鼠用右手提起小鼠尾部，放在实验台上，当其向前爬行时，左手抓住两耳及头颈部皮肤，再置小鼠于左手心，拉直四肢并用手指夹住肢体固定。右手可行注射或其它操作。大鼠右手轻轻抓住大鼠尾部向后轻拉，左手抓紧鼠两耳及头颈部皮肤，并将其固定在左手中，右手可行注射或其它操作。4.1.2.2实验动物的处理2.实验动物的抓取和固定方法兔1、可伤两肾；2、可造成皮下出血；3、可伤两耳；4、颈部皮肤厚可抓；5、用手拖住身体。4和5为正确的方法。豚鼠先用手掌以稳准的手法迅速扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指握住颈部，或握住身体的四周，再拿起来。怀孕或体重较大的豚鼠，应以另手托其臀部。4.1.2.2实验动物的处理4.实验动物的编号和标记方法染色法4.1.2.2实验动物的处理4.实验动物的编号和标记方法耳朵标记方法4.1.3实验动物的染毒和处置4.1.3.1实验动物染毒毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞经口＞皮内注射＞其他途径(如经皮等)。4.1.3.1实验动物染毒1.经口(胃肠道)染毒常用有喂饲、灌胃和吞咽胶囊等方式。(1)喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入。优点：简单易行，符合人类接触受试物的实际情况。缺点：如适口性差的受试物，动物拒食，摄入量达不到设计剂量；易挥发或易水解的受试物不适用。实验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒剂量。4.1.3.1实验动物染毒——经口(胃肠道)染毒(2)灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时(因小鼠消化吸收和代谢速度较快)，均不停饮水。灌胃后2～4小时提供饲料。经口多次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能。(3)吞咽胶囊：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至动物的舌后部，迫使动物咽下，此法剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。缺点是动物有咬伤人的危险。4.1.3.1实验动物染毒2.经呼吸道染毒经呼吸道染毒可分为吸入染毒和气管内注入。(1)静式吸入染毒：将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，加入易挥发的液态受试物或气态受试物使成一定浓度。染毒简易；但缺点较多，主要是随试验进行氧分压降低(因此，实验动物数量有限制)，柜内受试物浓度也逐渐下降(由于动物吸入消耗、为被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且实验动物有经皮吸收的可能。4.1.3.1实验动物染毒——经呼吸道染毒(2)动式吸入染毒：由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成。优点是在染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度较稳定；缺点是消耗受试物的量大，并易于污染环境。动式吸入染毒又分为整体接触和口鼻接触两种。动式吸入染毒柜中受试物的浓度应实际监测。(3)气管内注入：实验动物在麻醉后，将受试物注入气管，使之分布至两肺。此法用于建立急性中毒模型及尘肺研究。4.1.3.1实验动物染毒3.经皮肤染毒将受试动物皮肤表面涂抹一定量的受试物，再用纱布和塑料薄膜盖上，用胶布固定，接触规定的时间。经皮肤染毒的目的有两种。一种是经皮染毒毒性试验，如经皮LD50测定常用大鼠，皮肤致癌试验常用小鼠。另一种是皮肤刺激和致敏试验，皮肤刺激试验常用兔和豚鼠，皮肤致敏试验用豚鼠。4.1.3.1实验动物染毒4.注射染毒分为皮内注射、皮下注射、腹腔注射、肌内注射和静脉注射。对大小鼠可用静脉注射，非啮齿类可模拟临床用药途径，如狗可用后肢隐静脉注射，而啮齿类的尾静脉和肌肉注射难以多次染毒，必要时可改为皮下注射。静脉注射应控制速度，大鼠尾静脉注射最好控制在10秒以上。注射染毒应调整受试物的pH及渗透压，pH应5～8，最好是等渗溶液，动物对高渗的耐受力比低