食品中微生物检测

食品中微生物检测主要内容食品微生物检验的基本程序金黄色葡萄球菌检测（GB/T4789.10-2008）沙门氏菌检测（GB/T4789.4-2008）志贺氏菌检测（GB/T4789.5-2003）微生物检测生理生化反应（食品伙伴网）食品微生物检验的基本程序主要内容一．食品微生物检验的一般步骤二．检验前的准备三．样品的采集四．样品的送检五．样品的处理方法六．致病菌检验参考菌群的选择七．样品的检验八．检验结果的报告一.食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告无菌取样技术微生物检验的取样，必须要理解“无菌”的这一术语，“无菌”一般用于取样中，意味着取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。二.检验前的准备1.准备好所需的各种仪器。2.按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。3.准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必培养基。4.做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min.5.准备好采样必需的工具，器材。6.采样后样品运输、保存相关准备。三.样品的采集样品的种类1.大样，就是一整批；2.中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；3.小样，也称检样，做分析用的，一般为25g。采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明采样的要求1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。食品微生物检验的采样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。食品微生物检验的采样方案①ICMSF取样方案；②美国FDA的取样方案；③世界粮农组织（FAO）取样方案；④我国的食品取样方案。ICMSF(TheIntermationalCommitteeonMicrobiologicalSpecificationforFood)国际食品微生物标准委员会食品微生物检验采样方法采样原则：上能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.1、液体样品采样方法充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.2、半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。3、固体样品采样方法大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。4、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。5、生产工序监测采样①车间用水：从车间各龙头采样；②车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。③车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。平皿（七）采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。×××××采样单样品编号：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━产品名称（商品名）______规格型号__________注册商标_____________生产厂家_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□受检地点_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□采样地点_______________采样日期__________采样基数______________生产日期_______________批号__________产品依据标准__________有效成分及含量____________________________________________________________检验目地________________检测项目_____________________________采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章）签字签字日期年月日日期年月日备注四.样品的送检要求1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。五.样品的处理方法（一）液体样品（二）固体样品（三）冷冻样品(一)液体样品的处理1.瓶装液体样品的处理2.盒装或软塑料包装样品的处理1.瓶装液体样品的处理用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。2.盒装或软塑料包装样品的处理将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理1.捣碎均质法2.剪碎振摇法3.研磨法4.整粒振摇法5.胃蠕动均质法1.捣碎均质法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。2.剪碎振摇法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3.研磨法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4.整粒振摇法直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌（二）检验1、选择检验方法：国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等3、样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。（4）微生物检验不进行复检样品处理和试验准备（牛奶、羊肉、鸡肉）金葡球菌（牛奶25ml+225ml生理盐水）吸取15ml接入50ml7.5%NaCl肉汤37℃8-10h沙门氏菌羊肉or鸡肉25g剪碎+225mlBPW缓冲蛋白胨水37℃8-10h（前增菌加工食品直接增菌未加工）志贺氏菌羊肉or鸡肉25g剪碎+225mlGN增菌液37℃8-10h为了使生长加速37℃160rpm8-10h倒平板食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验生物学特性抗原构造及分型简介致病性流行病学检验方法菌肠毒素的检测快速检测方法菌污染的控制雪印牛奶中毒事件2000年6月29日起，日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、酸奶等3种牛奶制品被查出金黄色葡萄球菌毒素，造成1.5万名消费者中毒原因是在北海道的奶粉生产工厂（该厂的产品都是先制成奶粉，再在各地工厂还原成牛奶）出现了停电，使生产线上的原料停留过久，所以出现了细菌超标。2001年以后-借助其他公司支援开始分割公司事业。2002年雪印食品被解散生物学特性---菌体形态及培养特征革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长生物学特性---培养特征大多数菌株能生长在6.5-46℃之间（最适温度30-37℃）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.0-7.5）；大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化普通培养基生物学特性---菌体形态及培养特征好氧生长的细胞产生接触酶；产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸；所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。对分型进行简单的了解。１、血清学分型：金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一种表面抗原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。多糖抗原为半抗原，有型特异性。２、噬菌体分型。３、根据肠毒素分型。４、根据血浆凝固酶分型。金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型致病性金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。致病性金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。葡萄球菌皮肤感染致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。分布在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20℃-2