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微生物菌群的分离纯化、培养、鉴定及保藏——食品1201班第六组陈帆、刘旸、荣跃、龙开友实验目的和要求实验原理实验安排1、2、3、4、实验材料和器材实验方案内容1实验目的及要求1.1学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。1.2掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。1.3学习掌握菌种保藏的原理和方法。2实验原理•2.1菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。•2.1.1平板涂布法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。•用途：一般多用于从菌种的纯化；•优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；•缺点：不能计数•2.1.2平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。•用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。•优点：可以计数，可以观察菌落特征。•缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。•2.2大肠菌群的培养鉴定大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。•2.3菌种保藏菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的。3.1菌种污水中的大肠菌群。3.2培养基乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基。3.3器材4根接种环、干燥器、冰箱、4个250mL锥形瓶、3支产气管、17支试管、6套培养皿、14支无菌移液管(12支1mL管，2支10mL管)、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。3.4试剂革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液)、革兰氏三（95%乙醇）、革兰氏四（蕃红）、医用液体石腊（比重0.83～0.89）。3实验材料和器材•注：1乳糖胆盐液体培养基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和胆盐组成，属液态、鉴别、增值、半合成培养液，实验中用于废水中菌群的培养；2伊红美蓝琼脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、伊红-美蓝和琼脂。琼脂平板用于分离纯化肠道致病菌，特别是大肠菌群和粪大肠菌群；3营养琼脂培养基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂。用于分离纯化后的菌体培养。4实验方法和步骤•4.1实验安排•4.1.1实验准备•4.1.2采样、恒温培养富集及初筛；•4.1.3观察产气情况及稀释、倒培养基、划线、涂布、倒置培养；•4.1.4鉴定、接种；•4.1.5菌种保藏。4.2具体操作步骤•4.2.1实验准备4.2.1.1配置培养基(伊红美兰琼脂培养基：7.4g+200mL无菌水、调pH7.2~7.4，营养琼脂培养基：6.6g+200mL无菌水、调pH7.4±0.2,0.85%生理盐水、乳糖胆盐液体培养基2.6g+100mL无菌水，调pH7.4±0.2),，装瓶，高压蒸汽灭菌。4.2.1.2包扎好培养皿，移液管，试管，进行干热灭菌。4.2.1.3将配好的乳糖胆盐液体培养基分装入三个试管中，每个大约十毫升，包扎，灭菌。4.2.1.4液体石蜡和涂布棒等其他实验玻璃器进行灭菌。•4.2.2采样、培养取水，湖水，废水三样约2~3滴于3支已灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中，贴好标签（采样时间、人物、温度，采样地点及天气情况），塞好棉塞，于恒温箱（37℃）培养18~24小时•4.2.3观察产气情况、稀释•4.2.3.1观察产气管有无气柱，标记阳性管数。•4.3.2.2样品稀释：对已灭菌的5只试管编号（分别为1、2、3、4、5号），从样液试管取1mL样品液放入盛有9mL生理盐水的试管中为1号试管，换一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀释液。贴明标签。•4.2.4划线、涂布4.2.4.1涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。•涂布平板法操作：1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；2、取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s；4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。•（注意：1、将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。2、操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。）4.2.4.2平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散。在37℃经培养24小时后，可在平板表面得到单菌落。（有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。）•平板划线操作：1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞；3、将试管口通过火焰；4、将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液；5、将试管口通过火焰，并塞上棉塞；6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。8、将平板倒置，放入培养箱中培养。•4.2.5鉴定•4.2.5.1鉴定观察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，选取符合上述特征的单个菌落进行革兰氏染色，镜检（油镜）观察是否为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。•4.2.5.2培养•a将菌落转入装有玻璃珠的灭菌锥形瓶中调节酸碱度为7，充分摇匀备用。b液体发酵：取处理好的样品液1mL加入灭菌的乳糖胆盐液体培养基中。摇匀后置培养箱中37℃培养24小时•4.2.6菌种保藏•4.2.6.1斜面低温保藏法：此法为最常用的一种。一般霉菌；放线菌和有芽孢的细菌可保存2～4个月，酵母菌可保存2个月，无芽孢的细菌最好每周移接一次。操作过程如下：a接种：将要保藏的菌种接入斜面培养基上，试管上贴好标签，写上菌种名称，时间。b培养：各类菌按其所需温度和时间进行培养。c保藏：选取生长健壮的菌种，于其试管带棉塞的上半部用灭菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染杂菌。置于4℃冰箱中保藏。•4.2.6.2液体石腊保藏法：此法可用不分解石腊的菌种保藏。保存时间是半年至一年。放线菌；霉菌和产芽孢菌可保藏二年。液体石腊可防止培养基水分的蒸发，而引起的菌种死亡。同时可阻止氧气进入，防止好氧菌的生长。从而延长菌种保藏的时间。但需注意的是试管必须直立放置，并且不便携带。操作过程如下：a液体石腊的灭菌：将液体石腊装入锥形瓶中，量不超出锥形瓶体积的1/3，塞上棉塞，包扎好后，进行高压蒸汽灭菌二次（120℃30分钟）。再在110～120℃干燥箱中蒸发掉蒸汽灭菌时带入的水分。此时石腊透明清亮状。经检验确定无菌后备用。b菌种培养：将所需的菌种经培养后，选取健状的保藏。c加石腊油：用无菌管吸取石腊油加入菌种试管中，以高出菌种斜面顶点1cm为宜。少了会因培养基露出油面，而使培养基变干造成菌死亡。d收藏：试管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。e恢复使用：当要使用菌种时。倾出石腊油。此石腊油可再灭菌重复使用。接种培养。由于菌体外粘有油。第一次的菌生长缓慢，性状恢复不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌种。此外，实验结果记录应包括：1、观察记录乳糖胆盐培养基产气情况。2、观察EMB培养基上菌落（包括形态，质地，色泽，上述实验方案中有具体说明。）3、记录镜检结果。具体记录情况和实验总结等见实验报告。谢谢观赏！2014年5月9日