16十六基因诊断与基因治疗

1基因诊断与基因治疗GenediagnosisandgenetherapyCopyright©2012byRENLINZHU.Allrightsreserved.2第一节基因诊断Genediagnosis3传统诊断方法是通过表现型来推测基因型，基因诊断是从基因着手来推断表现型，即绕过基因产物，通过直接探查基因进行诊断，不受细胞类型和发病年龄的限制，可用于一切遗传病及癌症的诊断。4基因变异致病（1）内源基因的变异：基因结构突变和基因表达异常（2）外源基因的入侵5基因诊断一、基因诊断概述二、常用技术与方法三、应用6一、基因诊断概述(一)基因诊断的概念与特点(二)基因诊断的基本原理与临床意义7(一)基因诊断的概念与特点1．概念：指利用现代分子生物学和分子遗传学方法，通过检测基因的结构或表达功能的异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。基因诊断以DNA和RNA为诊断材料，DNA诊断RNA诊断82．基因诊断的特点：（1）直接检测基因，属病因诊断，针对性强；（2）特异性强、灵敏度高,获得稳定的结果：由于基因诊断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；（3）应用广、适用性强：其应用的范围已从原先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。(4)早期、快速诊断技术9(二)基因诊断的基本原理与临床意义1．基本原理：通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）的存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。2．临床意义:对有表型出现的疾病作出明确诊断,早期快速诊断确定个体对疾病的易感性疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等10•多年来,人们对与遗传因素有关的人类重大疾病，如肿瘤、心脑血管疾病、神经与精神性疾病等发病机制的研究一直未能取得重大突破。其中重要原因之一，是因为决定这些疾病易感性的基因不是一个，而是数个或数十个,即多基因遗传。每个个体对疾病易感性的高低取决于所携带易感基因的数目,携带易感基因数目越多，患病风险就越高。•然而,如何在整个基因组上筛检人类常见疾病、重大疾病的易感基因,则是医学遗传学研究所面临的主要挑战。如今,人类基因组计划的完成,以及基因组研究所构建的遗传图、物理图、DNA序列图、基因图、单个核苷酸多态性（SNPs）图,单倍型图，则为实现这一研究目标提供了强有力的研究工具。11二、基因诊断的常用技术12(一)基因诊断常用技术•核酸分子杂交•PCR（聚合酶链式反应）•以上二者的衍生技术•DNA测序13Southern印迹杂交法（Southernblotting）Northern印迹杂交法（Northernblotting）斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/Slotblothybridization）菌落杂交（colonyhybridization）夹心杂交法（sandwichhybridization）原位杂交（hybridizationinsitu）1.核酸分子杂交Molecularhybridization14(1)Southern印迹杂交法限制性内切酶酶切检测杂交信号提取DNASouthern法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。15（2）Northern印迹杂交法（其基本过程类似于上述Southern法）提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA16（3）斑点杂交或狭缝杂交法基本过程：将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。用途：检测样本中存在的微量DNA或RNA17（4）菌落杂交该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。18（5）夹心杂交法ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探针片断A检测探针本法优点：特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。19（6）原位杂交将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有202、PCR21PCR技术的优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术22PCR引物设计的一般原则引物长度G+C含量碱基分布的随机性引物自身引物之间引物的3’端引物的5’端引物的特异性23PCR扩增产物分析法凝胶电泳点杂交PCR-ELISA法243.DNAsequencing25a.Sanger的双脱氧链终止法Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2’，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。2627284.DNA芯片技术DNAchipsormicroarray29指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术的概念30(二)基因诊断的内容1.基因突变的检测2.多态性分析3.基因表达异常的检测4.外源基因的检测311.基因突变的检测点突变缺失插入基因重排染色体易位基因扩增……322.多态性分析人群中不同个体间基因的核苷酸序列存在着差异性，称为DNA的多态性。DNA多态性的发生可导致限制性内切酶识别位点的增加、缺失或易位，使DNA分子的限制性酶切位点数目、位置发生改变。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，即所谓限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）33RFLP分析法34×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析35+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析363.基因表达异常的诊断mRNA的定量分析：点杂交、逆转录PCR法、竞争性PCRmRNA长度分析：Northern印迹法DNA芯片技术：通过一次杂交即可平行检测成千上万个基因的表达状况，从而在RNA诊断上具有显著的优越性。374.外源基因的检测核酸分子杂交PCR技术38三、基因诊断的应用遗传性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断肿瘤的基因诊断基因诊断在法医学中的应用*基本策略39(一)遗传性疾病基因诊断策略1.直接诊断策略：采用基因突变的检测方法DNA较小范围的改变：PCR较长的DNA片段的突变：核酸分子杂交2.间接诊断策略：采用多态性连锁分析方法寻找具有基因缺陷的染色体，并判断被检者是否具有这条染色体。40(二)感染性疾病的基因诊断策略核酸分子杂交PCRDNA芯片技术对大多数感染性疾病作出明确的病原体诊断。不仅如此，而且能诊断出带菌者和潜在性感染；对病原体进行分类、分型鉴定等。外源基因的检测41(三)肿瘤的分子基础Oncogene(癌基因)ras(K-ras,N-ras,H-ras)myc,C-erB2…tumorsuppressorgene(抑癌基因)Rb,p53,BRCA1,BRCA2…tumormetastasisgenes(肿瘤转移基因)CD44…tumormetastasissuppressorgenenm23，WDNM………42肿瘤基因诊断的策略1.肿瘤相关基因的检测（1）检测肿瘤相关基因的突变癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等（2）检测肿瘤相关病毒的基因①与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤有关的EB病毒②与宫颈癌有关的人类乳头瘤病毒（HPV）③与肝癌有关的HBV、HCV④与成人T细胞性白血病、淋巴瘤有关的HTLV-1病毒等（3）检测肿瘤标志物基因432.肿瘤相关基因表达谱分析•基因表达谱(geneexpressionprofile)是指细胞中所有基因表达的格局,即细胞中所有的mRNA的总和.包含子细胞中所有功能基因及调节基因表达所需的调控元件.•肿瘤细胞是一群生长发生异常的细胞群,与相同来源的正常细胞相比,其在基因表达谱上肯定存在差异.44(四)基因诊断在法医学中的应用1．DNA指纹（DNAfingerprint）针对VNTR人工合成寡核苷酸探针与经过酶切的人基因组DNA进行Southern印迹杂交得到长度不等的杂交带而且杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就象人的指纹一样，因而把这种杂交带图谱称为DNA指纹。45AnalyzeDNAfingerprintstosolveahypotheticalpaternitycase46DNA指纹特点：①一个DNA指纹探针可同时检测十几个，甚至几十个位点的变异，因而DNA指纹更能反映基因组的特异性；②具有高特异性，只有同卵双生子女才会有完全相同的指纹；③具有稳定的遗传性，通过家系分析表明，DNA指纹谱中几乎每一条带都能在双亲之一的指纹谱中找到，而产生新带的概率仅为0.001%~0.004%之间；④DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，即从同一个体中不同组织、血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹完全一样。47小结基因诊断是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断的方法主要包括：①基因突变的检测；②多态性分析；③基因表达的检测；④外源DNA的检测。在这个过程中，常应用核酸分子杂交、PCRDNA序列测定、DNA芯片等技术。基因诊断已广泛应用于遗传病、感染性疾病、肿瘤的诊断及法医学等领域48第二节基因治疗Genetherapy491.药物治疗2.手术治疗3.放射治疗4.理疗传统治疗方法新的生物治疗：基因治疗(genetherapy)50基因治疗一、概念二、策略三、基因治疗的方式四、基本流程五、应用与展望51一、基因治疗的概念Genetherapyisamedicalinterventionbasedonmodificationofgeneticmaterialsinlivingcells.基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。52基因治疗概念的发展经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内，使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。53基因治疗的原理是:在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因（对健康有益的功能），或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因（错误信息），达到治疗疾病目的的治疗方法。它的主要过程就是先通过分子生物学手段诊断病人所缺陷的基因，再将健康人的正常基因植入病人体内，以取代有缺陷的基因，使正常基因得以表达，恢复该基因的功能，达到治疗基因病的目的。54二、基因治疗的策略(一)直接策略：针对致病基因(二)间接策略：导入与致病基因无直接联系的治疗基因55(一)直接策略1.基因矫正（genecorrection）2.基因置换（genereplacement）3.基因增补（geneaugmentation）又称为基因修饰,补偿性基因治疗4.基因失活（geneinactivation）又称为反义基因治疗561.基因矫正（genecor