CAR-T CAR-NK 在肿瘤中的应用现状及前景(三)

CAR-T细胞/CAR-NK细胞治疗在肿瘤中的应用现状及前景杨林博士1博生吉医药科技（苏州）有限公司苏州大学唐仲英血液学研究中心基于T细胞的免疫治疗在晚期癌症患者的临床试验中表现出非常好的治疗效果：•过继性自体T细胞治疗•CAR-T细胞治疗•抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1抗体治疗•等等。癌症免疫编辑T淋巴细胞是我们人体内最强大的杀伤细胞；杀伤性T细胞在肿瘤组织的存在与肿瘤患者生存期的延长紧密相关；癌症免疫编辑22014/11/10CAR-T细胞治疗技术解决了什么最关键的问题：靶向性持久性不依赖于MHC肿瘤免疫逃避T淋巴细胞是我们人体内最强大的杀伤细胞；杀伤性T细胞在肿瘤组织的存在与肿瘤患者生存期的延长紧密相关；肿瘤免疫治疗——十大科学突破居首细胞治疗应运而生80’s2011-LAKCIKCTLTILDC-CIKNKgDCTCRTCAR-T/CAR-NK肿瘤免疫治疗成为了第四大肿瘤综合治疗模式42014/11/10目录一.嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞（CAR-T）细胞治疗技术二.开展CAR-T细胞治疗研究前需要回答的几个关键问题三.我们已经建立的CAR-T细胞技术四.CAR-NK细胞治疗技术患有急性淋巴细胞白血病（ALL）的7岁女孩EmilyWhitehead，接受了CD19-CAR-T细胞治疗，获得完全缓解。2013年3月NEJM报道CAR-T细胞免疫治疗技术——癌症的终极疗法？Emily的故事52014/11/106一次治疗，根治肿瘤正常情况下T细胞的肿瘤杀伤机制82014/11/102014细胞治疗国际研讨会CAR的发展历程92014/11/10CAR的进化102014/11/10案例分析Kochenderfer,J.N.&Rosenberg,S.A.(2013)TreatingB-cellcancerwithTcellsexpressinganti-CD19chimericantigenreceptorsNat.Rev.Clin.Oncol.doi:10.1038/nrclinonc.2013.46112014/11/10靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗在复发性、难治性慢性淋性白血病（CLL）和急性淋性白血病（ALL）病人上成功诱导出持久的免疫应答、以及瞬间的细胞因子释放综合征靶向CD19的CAR结构示意图122014/11/10案例分析132014/11/10抗CD19CAR-T细胞治疗流程示意图抗CD19CAR-T细胞回输后，骨髓中淋巴瘤细胞和正常B细胞均被清除142014/11/10案例分析CLL病人在化疗后接受了抗CD19CAR-T细胞和白介素-2联合治疗，其骨髓和血液中的CLL细胞被完全完全清除152014/11/10案例分析162014/11/10CLL病人在化疗后接受了抗CD19CAR-T细胞和白介素-2联合治疗，其淋巴结肿大完全消退案例分析172014/11/10CD19CAR-T细胞治疗临床试验结果小结美国NCI成人自体抗CD19CAR-T细胞治疗结果小结182014/11/10宾州大学的CD19-CART临床数据(直接治疗为目的)32个CLL患者中的15个(47%)对这种疗法产生有效应答，其中7个患者的疾病得到了完全缓解。22个ALL儿童患者中的19个得到完全缓解(86%)。用这种疗法治疗的第一个儿童患者，现在已经8岁，其疾病在23个月之后仍保持缓解。经过治疗的首批5个成年ALL患者，到目前为止，仍处于完全缓解(100%)，其中治疗后最长的缓解期连续达6个月。诺华已经和宾大合作，开展大规模的临床实验纪念斯隆-凯特琳癌症中心的CD19-CART最新临床数据共有16位成人复发性B-ALL患者接受了CART19细胞治疗，所有患者的整体完全缓解率为88%在治疗前已检测出疾病的患者的完全缓解率为78%，远远高于补救性化疗的完全反应率（30%）。16名患者中有7人（44%）在治疗后成功接受了骨髓移；历史上，只有5%的复发性B-ALL患者能够过渡到接受骨髓移植。（《科学转化医学》杂志，2014年2月）其CART治疗目的：骨髓移植前的过渡疗法21CTL019的最新临床数据告诉了我们什么？病人筛选标准ⅹ无法进行异基因干细胞移植的复发性、难治性病人，或者alloSCT移植后复发的病人肝、肾功能正常PBMC对CD3/CD28刺激有良好应答AlloSCT6个月没有GVHD，在CART治疗前也不需要使用免疫抑制剂ⅹ病人的CNS状态为CNS3，或者具有不可控制的感染，以及hepatitisB、C、HIV为阳性临床方案0.76-20.6X106CTL019/Kg体重（1-10X108T细胞/Kg体重；≥50Kg病人，则接受5-50X108T细胞）提前1周进行淋巴细胞清除（Cy/VP;Flu/Cy;Flu/Cy-B;CVAD-B;CVAD-A）CTL019合格标准：结果30个儿童/成人难治性、复发性ALL：90%CR6个月无病生存率：67%；OS：78%6个月CTL019的持久率：68%B细胞发育不全：73%淋巴因子风暴：100%；其中，严重性淋巴因子风暴率为27%，与较高的肿瘤负荷相关，可被IL6R抗体tocilizumab缓解。•活细胞≥70%•CD3+细胞≥80%•内毒素3.5EU/ml•支原体、细菌、真菌：阴性•残留牛血清白蛋白：1g/ml•FACS检测的转染效率：≥2%•CAR的DNA拷贝数/细胞：0.02-4CAR-T细胞治疗中的常见肿瘤抗原222014/11/10美国已经批准的CAR-T细胞临床试验26CD138MultipleMyeloma232014/11/10肿瘤具有免疫逃逸能力，包括免疫抑制细胞在肿瘤位置的存在（Treg、髓源性抑制细胞、M2肿瘤相关巨噬细胞）、细胞因子（TGFb、IL-10）、以及抑制T细胞功能的相关蛋白的表达（B7-H家族蛋白、Fasligand）;CAR-T细胞归巢到肿瘤部位需要趋化因子的参与，但是不同肿瘤产生何种趋化因子来吸引T细胞还是大量未知的；T细胞运输到肿瘤部位可能还涉及到特定受体的活性。比如，内皮素B受体被发现会阻止T细胞迁移到卵巢癌，通过药物抑制该受体可以显著改善T细胞在肿瘤的浸润和临床应答；所以，对病人的预先筛选、对抑制性受体的预先阻断应该是提高CAR-T细胞治疗实体肿瘤效果的主要策略。CAR-T细胞技术在实体肿瘤治疗上的应用正常组织也表达肿瘤相关抗原而导致的脱靶毒性是CAR-T细胞治疗实体肿瘤的最大技术障碍242014/11/10实体肿瘤的CAR-T细胞治疗最近，新的尝试显示出治疗的光明前景。由June博士领导的小组在最新的临床试验中，通过将靶向间皮素（Mesothelin）的CARmRNA瞬转进病人T细胞，结果发现1例胰腺转移的晚期病人和1例晚期间皮瘤病人，均获得显著治疗效果，没有任何脱靶毒性发生。“WefoundthattheseCARTmesocellsnotonlyhaveantitumoractivity,butalsoactlikeavaccine,&triggeraresponseagainstthepatient’stumor,”saidDr.June.“ThisformofCARtherapyprovidesatooltoevaluateCARtherapiesforsolidcancers.”252014/11/10Mesothelin-specificchimericantigenreceptormRNA-engineeredTcellsinduceanti-tumoractivityinsolidmalignancies262014/11/10晚期胰腺癌和间皮瘤病人CAR-T治疗实例间皮瘤病人治疗效果胰腺癌病人治疗效果272014/11/10目录一.嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞（CAR-T）细胞治疗技术二.开展CAR-T细胞治疗研究前需要回答的几个关键问题三.我们已经建立的CAR-T细胞技术四.CAR-NK细胞治疗技术什么是最优化的CAR结构？282014/11/10第一代CAR抗原结合域：靶标特异性例如：scFv，配体CD3跨膜区：负责促进T细胞表面蛋白的相互作用CD3/Fc胞内信号区：T细胞激活区-抗原结合后导致第一信号通路的产生，并激活细胞毒活性和干扰素的分泌改良后的CAR胞外间隔区：对优化抗原结合是必须的例如：IgGFc片段，CD8改良的跨膜区：改变表达水平？改善共刺激信号域？例如：CD28，CD137第二代CAR信号域：提供共刺激信号，例如：CD28，CD137，CD134当抗原刺激第一信号通路后，可以上调抗细胞凋亡基因的表达、促进IL2分泌第三代CAR信号域：提供共刺激信号，例如：CD28+CD137，CD28+CD134当抗原刺激第一信号通路后，可以上调抗细胞凋亡基因的表达、促进IL2分泌什么样的T细胞亚群最适合CAR-T细胞治疗？现在的体外扩增方法能够得到处于晚期分化状态的效应T细胞，但是最新的研究强烈主张采用初始T细胞（TN）或者中心记忆T细胞（TCM），这些细胞比分化的T细胞具有更强大的体内杀伤活性。具体操作时，可通过类T细胞干细胞标记物CD62L进行T细胞分选，再转染CAR。292014/11/10什么样的T细胞转染手段是最佳的？方法优点缺点逆转录病毒转染效率较高细胞需要处于分裂状态，但会导致T细胞进入晚期分化阶段，从而影响CAR-T细胞治疗效果慢病毒细胞不需要进入分裂周期转染效率低。CD3/CD28抗体的刺激可以导致5-23%的转染效率。最近有报道IL-7会有助于慢病毒的转染，但需要观察IL-7是否影响T细胞的分化和肿瘤杀伤能力DNA表达质粒相较于病毒体系，治疗费用大幅度降低需要大量的DNA，以及药物抗性基因来进行CAR-T细胞的体外筛选。来自病人的对药物抗性基因的体液和细胞免疫应答会限制CAR-T细胞在体内的持续存在转座子系统与DNA表达载体相比，基因插入和整合的效率更高。Piggy-bac和睡美人系统可以直接转染原代T细胞得到稳定细胞株RNA表达水平高，转染可在CAR-T细胞回输前几天进行。mRNA-CAR-T临床试验已经证实其有效性。RNA转染效率较低，产生的CAR-T细胞体内活性时间短302014/11/10CAR-T细胞体外该如何扩增？当共同γ链细胞因子，例如IL-7、IL-15、IL-21加到扩增体系里，最终获得的T细胞的分化程度会更低，会更易获得具有TN/TCM特质的具有临床质量的CAR-T细胞。扩增方法主要有：1.磁珠抗体法2.aAPC法3.小规模生物反应器法当上述方法能够产生更适合临床治疗的T细胞表型后，可以预计将只需要比现在的方案更少的CAR-T细胞。实际上，最近的CD19CAR-T细胞治疗中，用量已经少到了1X107CAR-T细胞，从而可以极大促进CAR-T细胞治疗在各种临床中心的推广。312014/11/10CAR-T载体的工程化优化怎么做？•T细胞归巢（homing）的增强：共表达趋化因子CXCR2、CCR2b•TGF抑制CD4/CD8CAR-T细胞增殖：引入CD28共刺激因子•Treg存在时，CD28的共刺激会损害CAR-T细胞对肿瘤的迁移和杀伤：删除CD28endodomain的淋巴细胞特异性蛋白激酶（LCK）结合位点•面对大的肿瘤组织时，由于Treg的存在、部分肿瘤细胞丢失抗原等会影响CAR-T的治疗效果：共表达IL-12•构建双特异CAR-T322014/11/10CAR-T细胞治疗的未来发展方向332014/11/10寻找新的肿瘤相关抗原寻找最好的T细胞亚型＋改善CAR-T细胞疗效的策略＋改善CAR-T细胞的功能和存活时间更经济的CAR-T细胞制备技术＋＋＋342014/11/10目录一.嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞（CAR-T）细胞治疗技术二.开展CAR-T细胞治疗研究前需要回答的几个关键问题三.我们已经建立的CAR-T细胞技术四.CAR-NK细胞治疗技术开展CAR-T细胞治疗必