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12.10层析技术历史和概念分类常用的层析技术薄层层析法气相色谱技术高效液相色谱技术固相萃取技术22.10.1历史和概念——层析Chromatography1903,TsweettM.茨维特碳酸钙石油醚洗脱层析法，最早用于有色物质分离，因此也叫色谱法，色层法3层析技术的发展历程1931年Kuhn等在氧化铝和碳酸钙柱上制备性的分离了α,β-胡萝卜素1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，建立了分配层析1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法，促进了色谱理论的形成1958年，Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代4概念层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相为流过固定相的气体或液体，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。5固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。6吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。例如以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为：成盐作用配位作用氢键作用偶极作用范德华力作用有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。789石油醚环己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮吡啶乙醇甲醇水乙酸各种展开剂对极性有机物的溶解能力对极性有机物的溶解能力增强10根据层析分离机制柱层析薄层层析纸层析薄膜层析吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析气相(气-液;气-固)层析液相(液-液;液-固)层析根据两相所处状态根据操作形式不同2.10.2层析法分类112.10.3各种层析技术——吸附层析吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。主要吸附力：吸附能（化学吸附、物理吸附）吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。水分、粒度、吸附物分子大小、极性、特殊化学基团等对各种吸附剂吸附力有影响12纤维素，淀粉硅酸镁硫酸钙硅胶佛罗里硅土氧化镁中性氧化铝活性炭对极性有机物的吸附作用增强13对极性生物碱在硅胶上死吸附特别严重，可采用哪些途径调节实验？14吸附层析代表之一——活性炭层析非极性吸附剂（C-C键为主体），一般用于纯化、分离水溶性物质（也可用于非极性和弱极性），如甙类、氨基酸类、糖类前处理：一般先过筛，用稀盐酸洗涤，稀碱洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于120℃干燥4~5h后即可颗粒活性炭or粉末活性炭？作为非极性吸附剂，水溶液中吸附强，有机溶剂中吸附弱活性炭的内表面可高达1000m2/g硅胶600m2/g15研究认为，分子量在500～3000是活性炭可能吸附的范围，并随分子量的增大，吸附容量减小芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物在疏水性相当的条件下，对极性基团多的化合物吸附强于极性基团少的（与活性炭极性基团及表面水膜有关）161718纤维活性炭——新型的高性能活性炭吸附材料它是利用超细纤维如黏胶丝、酚醛纤维或腈纶纤维等制成毡状、绳状、布状等，经高温(1200K以上)炭化，用水蒸气活化后形成的。纤维活性炭的表面积大，高达1700m2/g，密度小(5～15kg/m3)，微孔多而均匀，绝大多数为0.0015～0.0030μm的小孔和中孔，因而吸附容量大，吸附和脱附速率高，残留量少，使用寿命长.吸附能力比一般的活性炭高出1～10倍，特别是对于一些恶臭物质的吸附量比颗粒活性炭要高40倍左右。19吸附层析代表之二——氧化铝柱层析酸性氧化铝pH约为4～4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5（仍属于碱性吸附剂范畴），用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9～10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等有独特的优势。醛、酮、酸、内酯等类型不易采用中性、碱性氧化铝分离粒度：100~160目20氧化铝的吸附活性与含水量关系极大，一般在200℃左右加温4~6h活化，然后按照下表加入一定量水来定等级，层析用氧化铝通常为Ⅲ级。氧化铝价格便宜，吸附量强于硅胶，对杂质吸附能力强于硅胶活性加入水量（%）ⅠⅡⅢⅣⅤ036101521用氧化铝柱分离长春碱和长春新碱的范例长春花碱(抗肿瘤药物)，英文vinblastine，用于何杰金氏病，淋巴细胞瘤，组织细胞淋巴瘤，组织细胞增生症X，晚期睾丸肿瘤，对其它化药物耐受的绒癌及乳腺癌。长春花HerbaCatharanthirosei，别名：雁来红、日日新、日日春、天天开，为夹竹桃科植物长春花Catharanthusroseus(L.)G.Don的全草22长春花总碱溶于甲醇长春花总碱的硫酸盐沉淀长春花总碱的硫酸盐水溶液氯仿萃取长春花总碱氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干23长春花总碱浸膏1g上30g氧化铝柱（Ⅲ级），柱内径︰柱长=1︰10重蒸的苯和氯仿混合溶液（比重1.3）洗脱分段收集并采用氧化铝薄层色谱进行检测合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶长春碱和长春新碱在1%硫酸铈铵的磷酸溶液下显紫红和灰蓝色氯仿-乙醚-石油醚(10:10:1v/v)为展层剂24通常所说的硅胶层析之一为吸附硅胶层析，载体硅胶具有多孔性的硅氧环（mSiO2·nH2O）。硅醇基显较弱的酸性。在甲醇和水中溶解度为0.01%，pH大于9时溶解度急剧上升。吸附层析代表之三——硅胶层析25硅胶活化：110℃下烘干1~2h，其吸附性也随着水分的增加而降低，超过12%，吸附力极弱，不能用作吸附层析，只能作为分配层析的载体。硅胶能吸附极性、非极性，饱和、不饱和分子，具有吸附层析和分配层析的双重特性。硅胶是中性偏酸性颗粒，且制备中接触强酸，常带酸性，又是弱酸性阳离子交换剂。前处理：检查水浸膏pH（不低于5），否则水洗至中性，110℃下烘干24h。特殊要求下需要经过6mol/L盐酸及氯仿等预洗。26干装和湿装干装时，先在柱底塞上少许玻璃纤维，再加入一些细粒石英砂，然后将准备好的吸附剂用漏斗慢慢加入干燥的色谱柱中，边加入边敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量的30～40倍，必要时可多达100倍。加够以后，在吸附剂上覆盖少许石英砂。湿装时，将准备好的吸附剂用适量展开剂调成可流动的糊，如干装时一样准备好色谱柱，将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中（提前放一半柱体积的展开剂），加入时不停敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有气泡和裂隙，还必须使吸附剂始终被展开剂覆盖。一般柱层析步骤——1）装柱272）洗柱干柱在使用前要洗柱，目的是排除吸附剂间隙中的空气，使吸附剂填充密实。洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选的展开剂，适当放开柱下端的旋塞。加入时先快加，再放慢滴加速度，使吸附剂始终被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身，排出气泡。283）上样和洗脱上样也分为干法和湿法干法为用比填料颗粒大的干燥硅胶加入待上样的溶液中，搅拌吸附样品后干燥成均匀的粉末后上样将待分离的混合物用最小量洗脱液溶解，小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附剂上的石英砂时，旋开滴液漏斗旋塞，滴加展开剂。滴加速度以1～2滴/秒为适度。整个过程中，应使展开剂始终覆盖吸附剂。29正确选择层析柱，正确使用层析柱30313233吸附层析代表之四——大孔吸附树脂大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附剂，也是一种亲脂性物质，它可以有效从很低浓度的溶液中吸附各种类型化合物（亲脂键、偶极离子、氢键等吸附方式，还有分子筛作用）。装柱、上样、洗脱都比较简单，吸附量大，吸附速度快，选择性好，机械强度高，解吸附容易。按基团的极性可分为极性、非极性、中极性。大孔吸附树脂的代表：三菱大孔吸附树脂HP20；国产D101大孔吸附树脂34CD180丙烯酸系用于提取分离丁胺卡那霉素等氨基糖苷类半合成抗生素860021苯乙烯系主要用于甜菊糖苷、人参皂苷的提取精制，有机物的分离LK-002脲醛系列主要用于银杏黄酮、山楂黄酮、大豆异黄酮等的吸附提取LK-001乙烯吡啶主要用于甜菊糖甙等的吸附提取DM131改进型树脂苯乙烯系主要用于银杏黄酮、人参皂甙、茶多酚等物的天然药提取和精制，具有吸附量大、二乙烯苯残留量低的优点，符合FDA的药用要求3536大孔吸附树脂应用举例氨基糖甙样品脱盐：将含盐的氨基糖甙，通过大孔吸附树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速通过树脂柱，去盐后可用(10-20)%的含水醇或丙酮洗脱吸附物冬虫夏草有效成分的吸附分离：H-103吸附树脂对核苷类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳香性氨基酸分离。37巯基纤维素nHMeRSMenRSHnn][巯基棉纤维是将巯基(HS-)连接在棉花的大分子链上而制成。巯基棉纤维对各种金属元素的结合能力有着明显的差异，其强弱顺序基本上符合软硬酸碱原则38Pt（Ⅱ）-Pd（Ⅱ）Au（Ⅲ）-Se（Ⅳ）Te（Ⅳ）As（Ⅲ）Hg（Ⅱ）-Ag（Ⅰ）Sb（Ⅲ）Bi（Ⅲ）Sn（Ⅱ）CH3Hg＋In（Ⅲ）-Pb（Ⅱ）Cd（Ⅱ）Zn（Ⅱ）巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（亲石元素）；而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫的金属成分可与较高浓度的K＋、Na＋、Mg2＋、Ca2＋、Sr2＋、Fe3＋、Mn2＋、Cr3＋分离。39巯基纤维素的应用举例化学发光测定水、血液和矿石中CoHg（Ⅱ）、Bi（Ⅲ）、Pb（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）干扰Co的化学发光测定，如何去除？在pH4条件下，让试液流过巯基棉，干扰离子被吸附，流出液可直接测定。40还有哪些吸附材料？聚氨酯泡沫塑料纳米分离富集材料壳聚糖磁微球……412.10.4分配层析分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠涂布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。吸附层析往往吸附过于强烈，分配层析则避免了这一缺陷。纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相（12%~20%的水），有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。42分配层析之一——纸层析影响纸层析的几大因素：物质的分子量物质的极性物质的电荷展开用的溶剂种类温度展开方式使用滤纸的种类其它43上行法44下行法45滤纸的选用对纸层析的影响型号标重(g/m2)厚度(mm)吸水性灰分(%)性能1900.17150-1200.08快速2900.16120-910.08中速3900.1590-600.08慢速41800.34151-1210.08快速51800.32120-910.08中速61800.3090-600.08慢速46双向纸层析1、两相常为酸碱差异的两相如乙酸乙酯、95%乙醇、6mol/LHCl（8：1：1V/V）为第一相，苯、丙酸、水（100：70：1V/V）为第二相；2、第一相展开后，取出挥发有机溶剂至干，然后可直接放入第二相中层析。举例：大豆异黄酮双向纸层析分析方法的研究47薄层层析