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病原性真菌检验河北省望都皮肤病防治院张维娜真菌（Fungus）具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）细胞壁含几丁质和（或）纤维素无根、茎、叶，不含叶绿素以腐生或寄生方式摄取养料能进行有性生殖和（或）无性繁殖第一部分病原性真菌概述•对人类致病的真菌分为：浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对治疗有顽固性，但影响身体较小，深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。一、生物学性状（一）形态结构•真菌细胞结构比细菌复杂细胞壁为几丁质(Chitin)（多聚N－乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。细胞内有较为典型的核结构和细胞器。真菌形态分单细胞和多细胞两类•单细胞真菌主要为酵母和类酵母菌（如隐球菌、念珠菌），呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。•多细胞真菌由菌丝和孢子组成菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（Mycelium），并长有各种孢子，这类真菌即一般称为霉菌（Mold）。•由于生活环境（如营养、温度、氧气等）的改变，有些真菌的孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌称为二相性真菌（dimorphicfungus），如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。真菌孢子和细菌芽胞的区别真菌孢子细菌芽胞抵抗力不强，60-70短时间杀死强，煮沸短时间不死数目一条菌丝可产生多个孢子一个细菌体只形成一个芽孢作用为繁殖方式之一不是繁殖方式形成位置可在细胞内外形成只在细菌细胞内形成形状形态、色泽多样圆形或椭圆形真菌的形态构成菌丝营养菌丝气生菌丝→生殖菌丝孢子有性孢子由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成绝大多数属于非致病性真菌所具有无性孢子分生孢子分生孢子梗的顶端或侧面大分生孢子小孢子菌属、表皮癣菌属小分生孢子毛癣菌属叶状孢子菌丝细胞直接形成芽生孢子隐球菌、念珠菌关节孢子厚膜孢子新型隐球菌子囊孢子菌丝末端形成膨大的囊状结构即孢子囊，内含很多孢子根霉菌真菌菌丝形态真菌孢子形态（二）培养特性•大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基（SDA）培养。•浅部病原性真菌的最适温度为22～28℃，生长缓慢，大多于1～4周出现典型菌落。•深部病原性真菌培养在37℃中生长最好，生长较快，经3-4天即长出菌落。真菌菌落类型类型定义特征颜色举例酵母型菌落为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖光滑、湿润，一般为乳白色新型隐珠菌类酵母型菌落外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，由伸长的芽生孢子形成光滑、湿润，一般为乳白色白色念珠菌丝状菌落为多细胞真菌的菌落，由许多管状、分枝菌丝体组成绒毛状、絮状、粉末状、颗粒状、石膏状。可产生各种色素。毛癣菌（三）变异性•真菌易发生变异，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现形态结构、菌落性状、色素及毒力等改变。（四）抵抗力•真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定的耐受力，但充分暴露于阳光，紫外线及干燥情况下大多数真菌可被杀死，且对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。•对热敏感，一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。二、致病性与免疫性（一）致病性真菌引起的疾病大致包括1.真菌性感染：主要是外源性感染•浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。•深部真菌侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。2．条件致病性真菌感染：主要是内源性感染（如白色念珠菌），亦有外源性感染（如曲霉菌）。3．过敏性真菌病：由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。4．真菌毒素中毒症：侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。（二）免疫性1．非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键，T细胞分泌的淋巴因子、以T细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤能局限和消灭真菌，以终止感染。三、微生物学诊断（一）直接检查1．不染色标本的直接镜检：直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。1）标本制备：2）检查方法：3）封固液：•①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。•②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）•。•③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。•④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。2．染色标本检查：1）革兰氏染色：各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。2）乳酸酚棉蓝染色3）糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。（二）培养检查•本法可确定菌种，辅助直接检查的不足；•通常用沙保氏培养基（SDA）（22～28℃）；•深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；（三）免疫学试验•用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。•检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断。乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原四、防治原则•真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生；•碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效；•制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效；•近年报道5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著；•二性霉素B可用于深部全身真菌感染。第二部分浅部真菌浅部真菌主要为皮肤丝状菌（Dermatophytes），侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌(Ringworm)，分为三属，共37个种。(一)、生物学特征皮肤癣菌的特征属名种数侵犯部位形态特征皮肤指甲毛发大分生孢子小分生孢子菌丝毛癣菌属21+++细长、棒形、壁薄，少见或无梨形、棒形，较多见螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状、破梳状，单纯细菌丝小孢子癣菌属15+-+纺锤形，壁较厚，较多见棒形，卵圆形，较少见球拍状及破梳状菌丝表皮癣菌属1++－梨形、壁较薄，多见无单纯菌丝（二）检验方法：•1．直接镜检：直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法2．分离培养：取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70％乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25℃培养7～14天，根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。毛癣菌属小孢子菌属表皮癣菌属3．荧光检查：本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。第三部分深部感染真菌•深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌。•多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变深部感染真菌分两大类：1.致病性真菌：此类真菌在正常人体内部不存在，一旦侵入机体，即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等，属外源性，我国少见；2.条件致病性真菌：是人体正常菌群的成员，当机体抵抗力下降时才致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。一、白色念珠菌•白色念珠菌（canidiaAlbicans）又称白色假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病。•为条件致病性真菌。（一）生物学特性•卵圆形，大小2μm×4μm，革兰氏染色阳性。•有假菌丝。•培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。•涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。（二）致病性和免疫性•白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起：1.皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处；2.粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。3.内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。•机体可产生一定免疫力。（三）检验方法及鉴定1．直接镜检：革兰氏染色镜检2．培养特点：典型的酵母菌落。3．鉴定试验1）芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，直37℃水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。2）TZC试验：将白色念珠菌接种于含0.005％氯化三本四氮唑的沙保培养基中，经22～25℃，24～48h培养，白色念珠菌不变色或仅淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。3）糖发酵和糖同化试验：根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。4）动物实验：本菌对兔有致病力。给兔耳静脉注射本菌，经4～5天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血，并有小脓肿，涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。5）厚膜孢子形成试验：本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯－80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。4．血清学诊断用于诊断全身性念珠菌病。以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体二、新型隐球菌•新型隐球菌又名溶组织酵母菌，是土壤，鸽类，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中。•可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染，对人类而言，它通常是条件致病菌。（一）生物学特性•较大球形，直径可达5～20um，•有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌，•用墨汁阴性显影法镜检，可见到透明荚膜包裹着菌细胞，•菌细胞常有出芽，但不生成假菌丝。•在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25及37℃皆可生长，而非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。•酵母型菌落，呈白色。•本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。（二）致病性•本菌大多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染。•侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。•此外可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。（三）微生物学检验1．直接镜检：常用墨汁涂片法。2．分离培养：在沙保培养基上，室温、37℃2～3天即可长出典型酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠。3．糖同化及发酵试验：本菌不发酵各种糖类，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇，不同化乳糖。4．酚氧化酶试验：在含Ｌ－多巴橘橼酸铁和咖啡酸培养基中，经２～５天培养，新型隐球菌出现棕黑色菌落。５．尿素酶试验：新型隐球菌产生尿素酶，在尿素培养基（含尿素及酚红指示剂）中分解尿素形成氨和CO2，以致培养基的pH值升高，使酚红由黄变为粉红色为阳性，而白色念珠菌为阴性。谢谢