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陕西理工学院·化学与环境科学学院·仪器分析实验教学组1仪器分析实验讲义07实验地点化学楼205实验学时3授课教师实验项目荧光光度法测定药片中VB2的含量预习提要（自主查找资料，实验时随机提问，预习成绩计分点）1.什么是荧光？2.荧光与分子结构的关系；3.荧光与溶剂环境的关系；4.了解荧光光度计的基本构造和操作步骤；5.激发波长、发射波长；6.荧光比色皿使用方法；7.荧光分光光度法定量分析原理；8.荧光分光光度法测定药品中VB2的分析原理。9.荧光分光光度法的特点(与紫外相比较)；10.标准曲线法。实验报告部分一、实验目的与要求1.掌握荧光分光光度计的基本构造和基本操作技术；2.学习荧光分光光度法测定药品中VB2的分析原理；3.掌握测定药品中VB2的方法。二、实验原理1.荧光：当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射光子的过程，称之为荧光。2.荧光分析法：荧光分析中包括激发光谱和发射光谱，是荧光物质的两个重要的性能指标。激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况；荧光光谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析法。3.荧光分光光度法定量分析原理：对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：F=Kc，K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。4.VB2的荧光光度法定量分析：VB2(即核黄素)在430～450nm光的照射下发出荧光，其峰值波长为530nm左右。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失，而且其荧光强度与其溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测VB2的含量。VB2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。5.荧光分光光度计基本操作陕西理工学院·化学与环境科学学院·仪器分析实验教学组2(1)接通电源，先打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器；(2)仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长=440nm(根据滤光片不同而不同)，发射波长=540nm。(3)样品测定。(4)退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。三、仪器与试剂1.仪器：F4600型荧光光度计(1台)、石英荧光比色皿(2只)、5mL吸量管1支、2mL吸量管1支、50mL棕色容量瓶7只、电子分析天平2.试剂：10.0μg·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存）、冰乙酸（AR）、药用VB2药片四、实验步骤1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：(1)在6个干净的50mL棕色容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00、2.50和3.00mLVB2标准溶液，各加入2.00mL冰乙酸，去离子水稀释至刻度，摇匀。(2)从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2.未知试样的配制与测定:(1)将VB2药片研磨成粉末状，精确称取2mg，用少量水溶解后转入50mL棕色容量瓶中，加2.00mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。(2)用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。五、数据记录1.标准溶液系列的浓度及荧光强度(三线表)2.未知样品的荧光强度(三线表)六、实验注意事项1.配制标准溶液时，为了减少仪器偏差，取不同体积的同种溶液应用同一移液管。2.因荧光是从石英比色皿下部通过，所以拿取石英比色皿时，应用手指捏住池体的上部(捏比色皿对角棱角)，不能接触下部。清洗样品池后，应先用吸水纸吸干四个面的液滴，再用擦镜纸往同一方向进行轻轻擦拭。3.在使用荧光分光光度计时，须按照既定程序进行。在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时，必须按顺序放入测定。4.在测试样品时，应注意样品的浓度不能太高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与荧光强度不呈线性关系，造成定量工作出现误差。5.此次实验影响标准曲线的线性的主要因素是配制溶液时的操作是否规范、标准。七、实验报告（结果与结论）1.画出荧光分光光度计构造图2.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线；3.根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算药片中VB2含量。(数据统计处理)八、思考题1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？九、实验学习与操作总结1.见紫外部分的要求。(所有实验均按该要求进行)陕西理工学院·化学与环境科学学院·仪器分析实验教学组3