第三章-培养基

第三章培养基教学目标:1.掌握培养基的种类及特点2.掌握培养基的组成和适宜剂量3.熟练掌握MS培养基配方、配制及高压灭菌（重点）4.了解生长调节物质的应用培养基种类成分生长调节物质的应用配制与灭菌教学内容1.培养基的种类及特点1.1培养基的发展简史培养基的产生最早是Sacks(1860)和knop(1861)对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，而设计出了由无机盐组成的Sacks和knop溶液，至今有的仍在利用作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基。培养基培养基(culturemedium)：含有各种被培养生物材料所需要的营养成分的培养基质。培养基是组织培养中最重要的基质，选择合适的培养基对培养成功与否关系很大。培养基有各种种类，不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发表人的名字来命名，再加上年号，如White(1943)培养基，Murashing和Skoog(1962)培养基。培养基种类完全培养基初代培养基继代培养基固体培养基液体培养基基本培养基诱导培养基增殖和生根培养基基本培养基根据培养基的无机盐成分和元素的浓度，可将培养基分为以下四类：1.富盐平衡培养基：MS培养基；LS培养基；BL培养基；BM培养基；ER培养基等。2.高硝态氮培养基：B5培养基；N6培养基；SH培养基等。3.中盐培养基：Miller培养基；H培养基；Nitsch培养基；Blaydes培养基。4.低盐培养基：White培养基；WS培养基；HE培养基；改良Nitsch培养基及HB培养基。几种基本培养基及特点:MS培养基—富盐平衡培养基：◆无机盐浓度较高（钾盐、铁盐、硝酸盐含量均较高），元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力；微量元素种类齐全，浓度高；培养基营养丰富，在一般的培养中，无需额外加入复杂的有机成分。◆能加速愈伤组织和培养物生长.◆广泛用于植物器官、花药、细胞及原生质体的培养。Miller培养基—中盐培养基◆大量元素无机盐用量是MS的1/3－1/2；微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸；无肌醇。◆适合于大豆愈伤组织的培养和花药等培养。几种基本培养基及特点White培养基—低盐培养基◆无机盐量较低；有机成分含量相对也较低。◆适合生根培养、胚胎培养等．B5培养基—高硝态氮培养基◆含有较高的硝酸钾，较低的铵态氮和较高VB1；◆较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。SH培养基—高硝态氮培养基◆特点与B5相似，硫酸铵改用磷酸二氢铵。◆无机盐浓度较高。几种基本培养基及特点:N6培养基：是我国学者创造（朱至清等，1975）获国家发明二等奖。主要特点：◆成分简单；◆硝酸钾和硫酸铵含量高；◆适合花粉、花药培养．KM-8P培养基：◆有机成分复杂，包括了所有单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸；◆主要用于原生质体培养(包括原生质融合的培养)。通气性较好，便于操作,但营养分布不均，生长发育不一致。营养分布均匀，生长发育整齐一致，但通气性差。固体培养基与液体培养基二、培养基的成分植物激素无机盐有机物培养体支持材料辅助物质水分2.1水分培养基大部分是水，配制培养基时一般用重蒸馏水，即蒸馏水再蒸馏一次，使水中不含或少含某些离子，保证培养基中成分完全人为控制。水的作用:1.水是细胞原生质的主要组成成分；2.水是重要代谢过程的反应物质和产物；3.细胞分裂及伸长都需要水分；4.水是植物物质吸收和运输及生化反应的良好溶剂；5.水能使植物保持固有姿态，有利于光合作用和传粉；6.调节植物体周围的温、湿度，维持植物体温稳定．2.2无机盐(inorganicelement)大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S等元素。以盐的形式加在培养基中，它们对植物细胞和组织的生长都是必不可少的，需要量大于0.5mmol/L。其中特别说明的是：培养基中无机氮的供应可以有两种形式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。微量元素：Fe，Mn，Zn，B，Cu，Co，Na，I等。对于植物细胞和组织的生长需要量小于0.5mmol/L，但必不可少，其中Fe较为关键，以螯合形式提供，可使用FeSO4.7H2O和Na2-EDTA进行制备。2.3有机物维生素肌醇氨基酸天然复合物椰乳香蕉泥水解酪蛋白碳水化合物马铃薯其它2.3.1肌醇主要生理作用:参与碳水化合物代谢；磷脂代谢及离子平衡作用；促进组织快速生长；对胚状体和芽的形成有良好影响常用浓度:50-100mg/L。2.3.2天然复合物天然复合物的成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显．椰乳是椰子的液体胚乳，主要含有活性物质。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10～20%，它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。椰乳(CM)香蕉泥1.对pH值缓冲大；2.用量150-200ml/L；3.应用在兰花组培。香蕉泥马铃薯：去皮和芽后使用，用量为150g/L-200g/L，煮30min，再经过滤，即可加入培养基。马铃薯汁也具有较大的pH缓冲作用，用添加马铃薯的培养基可得到健壮的植株。酵母提取液(YE)(0.01～0.05%)，主要成分氨基酸和维生素类。麦芽提取液(0.01～0.05%)；苹果汁、番茄汁、柑橘汁，黄瓜的果实，未熟玉米的胚乳等。以上这些天然复合物的特性是:遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。其它天然复合物主要有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白(LH)等，是重要的有机氮源。甘氨酸：能促进离体根的生长，对组织培养的生长也有良好的促进作用，通常用量为2-3mg/L；丝氨酸、谷氨酰胺：有利于花药胚状体或不定芽的分化；水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白(LH)：是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量是300-2000mg/L。2.3.3氨基酸(aminoacid)2.3.4碳水化合物•种类：蔗糖或葡萄糖、果糖等。•蔗糖浓度：2-3%，胚培养为4-15%。•作用：除提供碳骨架和能源，调节渗透压。注意：a.高压灭菌部分糖会分解。b.大生产时可用白砂糖。维生素以辅酶形式参与生物催化剂-酶系的活动，参与细胞的蛋白质、脂肪、糖代谢等重要生命活动。种类：VB1、VB6、Vc及生物素、叶酸、泛酸及泛酸钙等。浓度：0.1－1.0mg/L作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力VB6促根生长Vc防止组织褐变烟酸对植物的代谢过程和胚的发育都有一定作用。2.3.5维生素2.4植物激素主要包括：细胞分裂素(KT、ZT、6-BA、zip)；生长素(2,4-D、IAA、IBA、NAA)；赤霉素(GA3)等。2.5培养体支持材料1.琼脂：用量6－10g/L；种类琼脂粉、琼脂条；琼脂糖。作用固化作用；无营养。注意：琼脂使用有优缺点；新买应试凝固力。2.其它：玻璃纤维，滤纸桥，海绵等。2.6辅助性物质抗生素抗氧化物活性炭植物组织培养中材料的预先培养消毒只能进行表面灭菌，而对材料组织内部所带的细菌和霉菌的危害，则可在培养基中添加抗生物质。这对大量通气长期培养，也同样有效。常用的抗生素有：青霉素、链霉素、庆大霉素等；用量：5－20%；注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重。抗生素链霉素青霉素庆大霉素抗氧化物1.常用抗氧化剂：半胱氨酸、VC、PVP；2.用量：50－200mg/L；3.作用：防止氧化；抑制褐化，适用于热带木本及少数草本植物。4.注意：可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。人参等中药在组织培养中中药有其应用价值：实验表明表现出明显的促进作用，尤其是和适量的激素配合时，效果更好。使用的多种中药中又以人参效果更好。活性炭1.作用：具吸附作用；防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1－0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）；有利于胚胎培养。2.常用浓度：0.5－10g/L3.注意：活性炭具副作用。3.培养基的配制3.1母液的配制和保存3.2培养基的配制3.3pH值的调整3.4培养基的分装和灭菌3.1母液的配制和保存经常需在配制培养基时，为减少工作量，减少称量的误差，一般配成比所需浓度高10～100倍的母液，用时可按比例稀释。配好的母液需要贮存于2-4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。确定培养基称量计算溶解分装定容贴标签保存母液制备流程图MS培养基配方母液成分规定量（mg）扩大倍数称取量（mg）母液体积（ml）配1L培养基吸取量编号种类1大量元素KNO3190010190001000ml100mlNH4NO316501016500MgSO4.7H2O370103700KH2PO4170101700CaCl2.2H2O4401044002微量元素MnSO4.4H2O22.310022301000ml10mlZnSO4.7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4.2H2O0.2510025CuSO4.5H2O0.0251002.5CoCl2.6H2O0.0251002.53铁盐Na2-EDTA37.310037301000ml10mlFeSO4.7H2O27.810027804有机物甘氨酸2.050100500ml10ml盐酸硫胺素0.1505盐酸吡哆醇0.55025烟酸0.55025肌醇100505000移母液调pH值培养基熬制灭菌称取蔗糖、琼脂扎口分装定容接种确定配方3.2培养基制备当培养基配制好以后，应随即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存)，培养基pH值调整可用1mol/LHCl或1mol/LNaOH。经高压蒸汽灭菌后，由于某些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度会增加，即pH值可降低0.2。因此在实际操作中，经常在灭菌前将培养基的pH调节至比所需pH高0.2个单位。pH值的调整3.3pH值的调整培养基的pH值(培养基的酸碱度)，直接影响到培养物对离子的吸收，所以过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响，此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂不能很好的凝固。3.4培养基的分装和灭菌配制好的培养基需趁热分装，琼脂约在40℃时凝固，所以有充足的时间来进行分装工作。分装后应立即灭菌，灭菌时压力表读数为0.8～1.1kg/cm2，121℃时保持一定时间即可。培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间参考下表。培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间表容器的体积（ml）在121℃灭菌所需最少时间（min）20~501575~15020250~500251000304.生长调节物质的应用生长调节物质(Plantgrowthregulator)是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着决定性的作用。生长调节物质除存在于植物体中，也可人工合成。这方面的工作也是从20世纪30年代开始的，以后迅速发展，现在已可人工合成的种类相当多，可以说生长调节物质的研究、发展也是与植物组织培养的研究、发展相辅相成的。生长调节物质主要包括生长素、细胞分裂素等。生长素类种类：IAA；NAA；IBA；2,4－D作用：诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。浓度：0.05－5mg/L赤霉素（GA3）种类：GA3作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入．注意：不耐热。细胞分裂素（CTK）种类：6－BA，KT，ZT．作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖。浓度：0.05－10.0mg/L．生长调节物质的配制生长调节物质一般在水中直接溶解比较困难，常用溶剂及热稳定性参考下表，溶解后，再加重蒸馏水定容。为使操作方便，节省时间，生长调节物质也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。植物激素的常用溶剂及热