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第七章抗体酶或催化抗体抗体酶：20世纪80年代以来出现的一种具有催化活性的蛋白质，是利用生物学和化学的成果在分子水平上交叉渗透研究的产物；其本质上是免疫球蛋白，只是在其易变区被赋予了酶的属性，因此抗体酶又称为催化抗体（CatalyticAntibody)。Pauling过渡态理论和预言抗体若能与化学反应的过渡态结合，则这样的抗体必具有催化性能的观点抗体一旦能与过渡态结合，它就具有酶在温和条件下高效、转移地催化化学反应的性质，依此类推，抗体若能与过渡态相似物结合，则它也会与化学反应过程中的过渡态结合，这样的抗体亦具有催化性能Jencks于1969年提出意义Pauling和Jencks的理论催化抗体难单克隆技术1986年，Lerner和Schultz分别成功催化抗体的实现——Lerner(1984)提出：若以过渡态类似物为半抗原，则其诱发产生的抗体应该与该类似物具有互补构象；这种抗体与底物结合后，就能够诱导底物进入过渡态结构，从而引起催化作用。——1986年Lerner研究组在《Science》上发表了抗体酶研究的实验结果，标志着抗体酶的研究进入了一个新阶段。催化抗体自1986年诞生之日起，就一直是科学界高度关注的对象，催化抗体的研究是当今科学前沿的多学科交汇点之一研究的范围不断拓宽，研究成果层出不穷，采用的技术日益先进突破了传统的胶束、大分子、配位化合物等模拟酶研究的框框，开创了催化剂研究和制备的崭新领域在催化化学、反应动力学、医学、制药学等诸多领域的无可限量的应用前景催化抗体的定义抗体酶或催化抗体通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体该抗体除了具有相应免疫学性质外，还具有类似于酶能催化某些反应的特性催化抗体与酶的共同点催化抗体与酶的共同点抗体与酶都是蛋白质分子酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性能高选择性地与靶分子结合催化抗体与酶的不同点催化抗体与酶的不同点酶与高能态的过渡态分子相结合抗体则与抗原（基态分子）相结合大大降低化学反应的活化能，高选择性、高效率地催化化学反应，使之能在温和条件下得以实现抗体特异性地结合抗原并帮助巨噬细胞摄入且摧毁抗原半抗原与催化性抗体半抗原：是一类小分子化合物，本身不能诱导免疫应答，只有当共价结合到具有免疫性的蛋白质后，注射动物才能诱导出与半抗原特异性结合的抗体。如果半抗原是酶的过度态结构类似物，则有可能获得具有催化活性的抗体，也就是抗体酶。实例：以一羧基酯和酰胺的水解为例，根据反应机理，其过渡态应该为一个四面体结构，以具有四面体结构的高能中间类似物作为半抗原，均能获得预期的抗体酶；该抗体酶与过渡态类似物具有完全互补的立体结构。半抗原设计中应考虑的问题：产生的抗体是否具有预期的催化活性；能否刺激机体产生免疫应答。半抗原结构与催化抗体之间的关系：半抗原结构中应含有芳香结构：含芳香结构的半抗原具有较强的免疫原性；催化抗体与半抗原的亲和力：一般认为结合常数Ki应小于10-6mol/L，容易获得高效催化抗体；诱导羧酸酯、酰胺水解的催化抗体，可以利用具有四面体结构的过渡态类似物作为半抗原；半抗原的设计应考虑催化反应的环境与反应机制。自从抗体酶制备成功以来，迄今已成功地开发出天然酶所催化的六种酶促反应和数十种类型的常规反应的抗体酶。——包括酯、羧酸和酰胺键的水解反应、酰胺形成、光诱导裂解和聚合、酯交换、内酯化、Claisen重排反应、金属螯合、环氧化反应、氧化还原反应、化学上不利的环化反应、肽键形成反应、脱羧反应、过氧化反应、周环反应等。抗体酶催化的反应专一性相当于或超过酶反应的专一性，催化速度有的可达到酶催化的水平。——但一般来说，抗体酶催化反应的速度比非催化反应快102~106倍，仍比天然酶催化反应速度慢102~104倍。因此，开发制备高活力抗体酶的方法仍是世界各国科学家的奋斗目标。抗体酶的发现不仅提供了研究生物催化过程的新途径，而且能为生物学、化学和医学提供具有高度特异性的人工生物催化剂，并可以根据需要使人们获得具有某些不能被酶催化或较难催化的化学反应催化剂。抗体酶的出现，意味着有可能出现简单有效的方法，从而人们可凭主观愿望来设计蛋白质。——这一发现是利用生物学与化学成果在分子水平上交叉渗透研究的产物。由于抗体酶对于多学科展示了较高的理论和实用价值，已引起科学界广泛的关注。抗体抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质抗体分子：由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）结合区：抗体分子上有两个抗原结合区可变区（V区）稳定区（C区）抗体的结构单克隆抗体单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体单克隆抗体的制备过程细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备动物免疫与亲本细胞的选择杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等单克隆抗体的纯化催化抗体的例子Haynes等在3.0Å水平上测定了具有分支酸变位酶活力的抗体酶1F7与其过渡态类似物的复合物的三维结构。——晶体结构数据表明，过渡态类似物是结合在可变区6个CDR(Complem-entaritydeterminativeregion,互补决定域)的顶端，主要是和重链结合，有7个残基与其结合，而轻链只有1个残基与之结合。这同其他的抗体是一致的。抗体与半抗原的识别包括了疏水、静电和氢键等的相互作用。半抗原在抗体结合部位中的取向是由它的2个羧基的特异相互作用决定的。C10羧基与Tyr-L94的酚基形成氢键而固定；而C11羧基则是半抗原被包埋得较多的部分。它可能与水分子形成氢键，这个水分子再同ASP-H97主链羧基氧形成氢键。过渡态类似物同1F7(A)和分支酸变位酶(B)之间的有关侧链的相互作用示意图Arg-95H侧链处于C-11羧基的上面，这个位置也使它靠近过渡态类似物的醚氧基，以提供静电互补，同时该残基还部分地保护了配体同溶剂的接触。因为已有分枝酸变位酶与上述同一过渡态类似物的复合物的2.2Å晶体结构，因而有可能对酶复合物与抗体酶复合物进行结构比较。结果表明，二者的催化机理完全类似，但抗体酶的活性部位是在相邻两个亚基的界面上，从而与所结合的过渡态类似物形成了广泛的疏水键、离子键和极性键。过渡态类似物与酶结合的解离常数Ki为3μmol，比1F7(Ki=0.6μmol)大约高5倍，说明酶与过渡态类似物之间的匹配更为精确，其间有更多的静电相互作用，包括2个精氨酸的正电荷和一个谷氨酸的负电荷，这可能就是抗体酶活力比相应天然酶活力低104倍的原因。Zhou等由N-酰基氨基酸苯酯的过渡态类似物诱导产生抗体17E8，能催化甲酰甲硫氨酸（或正亮氨酸）苯酯水解生成甲酰甲硫氨酸或甲酰正亮氨酸抗体酶17E8催化氨基酸酯的反应他们在2.5Å水平上测定了17E8与其半抗原的三维空间结构。17E8Fab的总结构与其它抗体很类似。半抗原4结合在轻链和重链CDR3之间的裂缝中，其羧基位于裂缝入口处，并被5个Tyr所包围。半抗原和抗体之间有14个氨基酸发生相互作用，包含6个氢键和范德华键。结构和动力学数据都说明抗体酶的水解机理与丝氨酸蛋白酶极为相似。抗体酶结合部位含有一个Ser-His二体结构，靠近结合抗原的磷原子，这与丝氨酸蛋白水解酶的电荷中继系统Ser-His-ASP成分中的二个相似。抗体结合部位中还含有Lys残基，用于稳定负氧离子形成和识别底物的疏水口袋。——催化抗体-半抗原复合物的高分辨结构证明，抗体能够把经过天然酶进化而出现的活性部位结构会聚到一起。Schultz小组制备了水解甲基对硝基苯基碳酸酯的抗体48G7与其半抗原p-硝基苯基-4-羧丁基磷酸酯的复合物的晶体，并对其进行了X-射线衍射分析，发现抗体结合部位的共有模块含有碱性残基，它能与磷酸氧发生静电相互作用产生所谓氧阴离子洞(Oxyanionhole)。稳定半抗原是通过下列因素实现的：带正电的Arg-L96与带负电的磷氧基靠近，形成静电吸引；由His-H35，Tyr-H33和Tyr-L94与磷氧基的氧形成的氢键。抗体酶48G7(右侧)与它的磷酸酯半抗原(左侧)相互作用示意图Charbonnier等对未配位的催化Fab(结合抗原的抗体片断)D2.3，它与底物类似物的复合物以及它与磷酸酯半抗原的复合物的X-射线晶体结构进行了比较，结果完全阐明了催化机理，发现漏斗形的沟槽使水很容易扩散至深埋抗体中的反应中心。反应中心在碱性pH下通过优先稳定带负电的氧阴离子中间体而起作用，中间体是由羟基化物进攻p-硝基苯基酯底物产生的。Lerner小组用定点突变技术将金属离子引入抗荧光素抗体的结合部位。半抗原-抗体的晶体结构显示，轻链互补决定区中的3个残基在相对几何学上类似于碳酸酐酶中锌结合部位上的3个组氨酸残基，因此，用组氨酸取代抗体残基Arg34L、Ser89L和Ser91L。为避免对金属结合部位的可能的空间障碍，用亮氨酸取代Tyr36L。经过这样改造后的抗体不仅仍能结合荧光素，而且还能结合Cu(ll)、Zn(ll)和Cd(ll)。这种将金属结合部位引入抗体的能力十分重要，因为金属离子可催化各种类型的反应。定点突变法作为蛋白质工程的基本手段之一可精确改变蛋白质肽链上的任一氨基酸残基，因此，可用来阐明某一氨基酸残基在抗体结合和催化中的作用。从鼠骨髓瘤细胞产生的一系列能和磷酸胆碱结合的抗体已被广泛研究过，有的还做过X-射线衍射结构分析，发现重链上的两个氨基酸残基Arg-52H及Tyr-33H在所有的能结合磷酸胆碱的抗体中都存在，所以认为这两个残基对抗体的结合及催化作用起关键作用。Jackson等在研究能结合磷酸胆碱的抗体S107时，对Tyr-33H和Arg-52H都做了突变，分别获得4个Tyr-33突变体和3个Arg-52突变体。一般来说，Tyr-33的突变体催化活力没有变化；而Arg-52的突变体由于丧失了带正电侧链，催化活力显著降低。这说明，静电相互作用对S107的催化作用至关重要，也说明将有催化作用的残基引入到抗体中，可以增加抗体酶的催化活性。有意思的是Tyr-33H的突变体(Y33H)可使抗体活性提高50倍(kcat=5.7min-1，Km=1.6mM)，引入的组氨酸可能起广义的酸碱催化作用。用烷基磷酰胺(phosphonamidate)半抗原诱导产生的单抗NPN43C9是动力学和催化机制研究的最多的抗体酶之一，很适合作为突变的模型用于研究抗体酶结构与功能的关系。Roberts等为了检测NPN43C9的催化机理，用抗体结构数据库(ASD)构建了该抗体可变区的三维模型。该模型显示ArgL96的胍基处于抗原结合部位的底部，并与抗原的磷酰胺基（该基团模拟四面体过渡态的负电荷）形成盐桥。因此该模型预计ArgL96与抗体的结合与催化功能相关。计算机模拟和实验结果都证实，催化抗体NPN43C9的催化机理是稳定催化作用中的高能过渡态。催化抗体制备方法催化抗体制备方法拷贝法单克隆技术天然来源分离法基因工程蛋白质工程化学修饰新的方法和技术不断出现稳定过渡态法1稳定过渡态法1986年发表的两篇在抗体酶的实践上有重要突破的工作，标志着抗体酶的研究进入一个崭新的阶段。起初的设计思想是以Pauling的稳定过渡态理论为指导，即利用反应的过渡态类似物作为半抗原产生抗体酶的。随着抗体酶研究的深入，人们利用了酶催化业已确立的催化机理：——①稳定过渡态;——②酸碱催化；——③亲电和亲核催化；——④邻近效应使抗体酶的制备方法不断扩展，目前已开发出数种产生抗体酶的方法。迄今，大多数抗体酶是通过理论设计合适的与反应过渡态类似的小分子作为半抗原，然后让动物免疫系统产生针对半抗原的抗体来获得的。由于以反应的过渡态类似物为半抗原诱导的抗体在几何形状和电学性质上与反应过渡态互补，因而稳定了过渡态，从而加速反应。在这方面最早设计出的催化抗体是酰基转移反应，尤其象酯水解反应这样的具有较低活化能的反应。Lerner小组根据金属肽