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实验室诊断（一）皮肤病1显微镜的正确使用1、开电源开关2、调光（光圈、聚光器）3、低倍镜头对准通光孔4、将要观察的部位调到通光孔正中2显微镜的正确使用5、用粗调焦手轮,调节焦距，使载物台上升6、不能上升时再调节载物台下降，到视野中出现清晰的物象止；7、瞳距调节：左右推拉目镜，调节屈光度3显微镜使用的注意事项•使用高倍镜、油镜时，应按从低倍镜逐步至高倍镜，用细调节器螺旋调节。•使用完毕转动粗调手轮将工作台下降到底；•每次油镜用后，必须用擦镜纸擦去镜头上的油镜油；•使用后4-10倍镜间把镜头八字形放置，镜体复原。4显微镜使用的注意事项•忌频繁开关显微镜电源，临时不用时只需将光源亮度调至最弱。•重找或换片时的顺序：1、在加油区外应按：低倍→高倍→油镜2、在加油区内重找应按：低倍→油镜5显微镜的维护对于显微镜的维护保养，主要做到防尘、防潮、防热、防腐蚀。用后及时清洗擦拭干净，并定期在有关部位加注中性润滑油脂。对于一些结构复杂，装配精密的零部件，如果没有一定的专业知识，一定的技能和专用工具，就不能擅自拆装，以免损坏零部件。（不能放在离心机附近！）6皮肤片在显微镜下的适用倍数•癣菌：40X10、100X10镜•螨虫：10X10、20X10镜•细菌：40X10、100X10镜•马拉色氏菌：40X10、100X10镜•细胞学：40X10、100X10镜7病变分布•局部•多处•全身•对称性分布•非对称性分布8皮肤病变特征9皮肤病变特征10皮肤病变特征11皮肤病变特征12皮肤病采样前准备•了解患病动物的病史：包括性别、年龄、是否绝育、皮肤瘙痒程度、持续时间、病变部位、临床症状、有无季节性、食物种类、生活环境、用药史、用药时间等。•观察皮肤的整体印象，包括：皮肤及被毛干燥、油腻、易掉毛、气味等•观察有无跳蚤、跳蚤排泄物、虱子、蜱等•与主人沟通，了解有无新生的患处，瘙痒最严重部位等，最好刮取新生病变与健康皮肤交界处，取2-3处病变局部剪毛，（75%酒精稍作擦拭），采样。13采样工具的准备•剪毛剪1把、手术刀2把（钝刀片）、止血钳一把、载玻片、盖玻片、碘酒棉球、酒精棉球•在载玻片上分两点各滴上一滴50%甘油（主要查看螨虫类）和10%KOH（主要查看真菌类）备用•干净的载玻片备用（主要查看细胞、细菌类）•根据采样方法还可选择胶带、伍德氏灯等14采样基本工具15刮片法流程•刮片法：适用于检查疥螨、皮肤癣菌等•采样的处局部剪毛（剪毛部要大于要刮取的病变部）•用手术刀轻轻刮取新患部与健康皮肤交界处（1）其中一把手术刀刮取皮肤表层皮屑置于事先准备好的10%KOH中（起到透明化作用）备用，主要查看真菌（2）表层刮取后，用手挤压其患部，并用另一把手术刀将挤压处毛囊内的皮肤表层下刮取物置于事先准备好的50%甘油中（起到固定和透明化作用）备用，主要查看螨虫•在另一患处做同样的取样，分别将刮取物置于载玻片上相应的溶液中•取盖玻片分别将刮取物轻轻按压，尽量使刮取物与溶液混匀•采样结束后，在采样部位涂擦碘酒消毒16拔毛法流程•拔毛法：适用于查看外寄生虫、蠕形螨、皮肤癣菌，毛发形态等•在病变处用止血钳拔出少量毛发（连同毛根拔出），置于KOH中/甘油中备用17挤压法流程•挤压法：适用于查看蠕形螨•在病变部位，以拇指和食指捏起皮肤，用力挤，使毛囊扩张，用刀片刮取经挤压毛囊液置于甘油中备用18胶带法流程•胶带法：适用于查看外寄生虫、癣菌、细菌、细胞学•选择合适的透明胶带，在患病处皮肤上粘取一些皮屑和组织碎片，粘置于载玻片上备用19抹片法流程•抹片法：适用于查看细菌，癣菌，细胞学等•在用刀片浅层刮取后，直接用载玻片于皮肤上按压，尽量较均匀涂满玻片，火焰固定或自然晾干备用20伍德氏灯检查法•伍氏灯：适用于查看部分小孢子属的癣菌感染•用手提式伍德氏灯在暗室内开启灯光，预热5-10分钟，光源与皮肤距离约5-10cm左右，光线对准被检处，观察有无荧光出现21染色法流程•细菌、马拉色氏菌：通常临床使用革兰氏染色法。操作步骤：1、抹片后自然晾干或采用火焰固定（待玻片完全恢复常温）2、按照革兰氏染色步骤进行染色3、晾干或用滤纸沾去玻片表面的水份备用•细胞：通常临床使用瑞-姬氏染色法或迪夫染色法。（操作步骤同上）22常用染色液用途及步骤瑞氏-姬姆萨染色液（主要用于血液、骨髓、脱落细胞的涂片等）染色步骤：瑞氏-姬姆萨A液1-2滴；瑞氏-姬姆萨B液2-4滴；将AB液混匀，静止3-5分钟左右---水洗---甩干---镜检23常用染色液用途及步骤迪夫染色液（主要用于血液、骨髓、脱落细胞的涂片等）染色步骤：迪夫A液浸泡30秒---磷酸盐缓冲液冲洗A液---甩干---迪夫B液浸泡30秒---水洗---甩干---镜检24常用染色液用途及步骤革兰氏染色液（主要用于区分G+菌和G-菌）染色步骤：龙胆紫---10秒---水洗---甩干---碘溶液---10秒---水洗---甩干---脱色液---10秒---水洗---甩干---沙黄溶液---10秒---水洗---甩干---镜检25蠕形螨疥螨姬螯螨癣菌细菌马拉色氏菌过敏性皮炎细胞学26蠕形螨27蠕形螨28蠕形螨•整个生活史共需24d；•虫体寄生于皮肤毛囊和皮脂腺内；•有4对足，口器小，体表无毛，吻突小而钝，•正常犬猫体表均会有少量蠕形蟎存在；•病变以动物眼、唇、耳、前肢内侧的无毛处；•病变周围有界限分明的红斑，痒感不强烈。但严重时，身体大面积脱毛、浮肿、皮脂溢和脓性皮炎；•本病是一种可以使动物致死的外寄生虫病；29蠕形螨临床症状皮损可出现头面部、趾（指）部。临床症状各异，起初常为局灶性皮损，随后扩大，出现斑片状、局灶性、多灶性或弥漫性脱毛，伴有各种红斑、皮屑、丘疹、瘙痒等，感染皮肤可能出现苔藓化、色素过度沉着、脓包、糜烂、浅表性溃疡或深部脓皮病。30蠕形螨（刮片的要点）•临床上多以头面部、四肢关节处刮片较容易检测；•刮片时应挤压或拔毛；31雌雄疥螨32疥螨•卵经3-8d孵化成幼虫，移至皮肤表面蜕皮发育为1期幼虫、2期幼虫和成虫。整个生活史需10-14d；•虫体终生寄生于皮肤内•虫体呈卵圆形，体表覆以平行的细毛，有三对足•直接接触传染，具有高度传染性，可引起患畜剧烈的瘙痒，导致自我擦伤•寄生于外耳、面部、肘部，严重时波及全身；•局部表现脱毛、丘疹、红斑、皮肤增厚和结痂33疥螨（刮片要点）•能挖掘隧道，刮片时应多摩擦，反复刮；•临床上病变常以耳部刮取较容易检测；•临床上以剧烈瘙痒为典型症状；34姬螯螨35姬螯螨36姬螯螨•无严格的宿主特异性，以幼犬多发•以组织液为食，不打洞，有大量皮屑•姬螯螨虫体很大，有4对腿，末端呈梳子状，最具特征的是钩子样的附属口器或触须，称为螯针，这是与其他螨虫鉴别的重要标志。•寄生于宿主的表皮角质层，在皮屑形成的假隧道内快速移动，会定期用螯针刺入表皮，从而将自己牢牢固定在皮肤上3738真菌•真菌主要包括酵母菌、霉菌、癣菌三大类•临床上引起犬、猫皮肤真菌病的主要为癣菌，分别有犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌•犬小孢子菌和须毛癣菌属亲动物型，主要侵害动物；石膏样小孢子菌是亲土壤型，多数腐生于土壤中，也可感染人和动物•皮肤癣菌对外界的抵抗力很强。犬小孢子菌能在干燥环境中长达13个月保持活性，有些甚至可存活几年39癣菌•浅部癣菌主要为皮肤丝状菌，侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌•癣症病灶可见有隔菌丝和关节孢子；菌丝深入角化组织内生成营养菌丝体，纵横交织成网状；孢子可排列成链状或零散分布，在病发上可见孢子在毛干外排成厚鞘40伍德氏灯下癣菌41癣菌引起的朽木样毛发4243孢子（10*10和10*20）44孢子100*1045孢子46↓20*10↓40*1047孢子48菌丝瑞-姬氏染色49真菌培养50细菌•临床以G+球菌、链球菌多见•大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌51酵母菌厚皮马拉色氏菌•红斑、黄色皮屑和结痂，油腻和恶臭皮肤•多见于面部、趾部、颈腹侧、腹部、指间、皮肤皱褶处•瘙痒52过敏性皮炎•多见于过敏性引起的皮肤病；•皮肤刮片染色可见嗜酸性粒细胞；53耳道检查采样工具的准备•两根棉签、两张载玻片采样用棉签取患病耳道深处的分泌物，在玻片上涂抹均匀。检查方法•将一张样本片火焰固定、染片后观察细菌和真菌。•另一张直接看活片，检查是否有螨虫。耳道常见菌•耳道感染常见的真菌：主要是马拉色氏菌常见细菌：球菌耳道常见寄生虫•耳痒螨：寄生于外耳道，它们采食表皮碎屑并对患病动物造成严重的刺激，感染通常是双侧的，表现为甩头和搔抓耳部。严重的感染可以引起中耳炎，继续发展可能形成耳血肿。临床多见于猫的耳痒螨感染，感染耳痒螨的猫耳道内常有大量棕黑色的分泌物，分泌物多干结成块。耳痒螨可以通过直接接触在犬猫群中高度传播。耳痒螨•虫体呈卵圆形，足较疥螨长,有4对足，从卵到成虫需要2—3周细胞学（部分借鉴于陈宇驰老师课件）59穿刺的技术与要领1、尽量避免反复穿刺2、以左手触摸穿刺物，右手持注射器一次进针（进针深浅根据穿刺物大小），拔出再进针（只限在穿刺物内，不可将针头拔出皮肤外），反复3-4次操作即可60穿刺的准备1、选择适当的注射器（一般建议20G-40G的针头和5-20ml的针管）2、清理病灶表面,必须严格无菌操作，以防感染3、穿刺的部位（怀疑是肿瘤时，穿刺的部位应是手术时会切除的部位）61穿刺的方法1、细针抽吸：A注射器刺入被检样本B拉动活塞并使针头部分在被检样本内以不同角度刺入C松开活塞D拔出注射器62穿刺的方法2、细针活检：适用于细胞较脆弱的组织，如淋巴结，或是采集样本部位的血管比较丰富，或是用细针抽吸方法会采到血液或是其他类型液体使之不易判读时方法：A拉开注射器活塞B使针头部分在被检样本内以不同角度刺入C拔出注射器63制片的技术与要领1、推片技术（适用于淋巴活检组织这样比较脆弱的样本或含有较多液性成分的样本）2、拉片技术（同上）3、海星技术（适用于细胞脆弱，而且是液性的样本）4、压片技术（适用于不易采到样本的固体）64恶性细胞核标准1、巨型细胞核2、细胞核大小不等3、核仁不规则（大小、形态、数量）4、非典型，不对称的有丝分裂相5、染色质粗糙65肥大细胞瘤→•恶性•预后不良↓恶性•预后良好1.圆形细胞瘤2.细胞质或细胞外可见大量嗜碱性染色的颗粒3.“煎蛋样”外观4.预后较复杂66淋巴瘤1.发生于皮肤的病灶早期出现皮屑和瘙痒，后形成结痂2.*细胞核呈现明显嗜碱性染色；*部分细胞核中可见明显巨大核仁或多个核仁；*染色质质地粗糙，染色性低于正常淋巴细胞；67传染性性病肿瘤•淡蓝色或烟灰色胞浆•细胞核多偏于细胞一侧•细胞质内可见数量不等的透明空泡68基底细胞瘤•良性•预后良好•一般仅在局部呈浸润性生长，很少发生转移•是皮肤癌肿最多见的一种69组织细胞瘤•圆形细胞；细胞大小不均，细胞质数量较多，淡染甚至不着色；细胞核偏于细胞质一侧70浆细胞瘤•圆形细胞；细胞质数量较多，轻度到中度嗜碱性染色；细胞核偏于细胞质一侧；细胞核边缘可见月牙形或时椭圆形淡染区71间质细胞瘤纤维瘤脂肪瘤纤维肉瘤72黑色素瘤•胞浆中有大量黑褐色颗粒•临床一般通过生长部位确定预后•恶性（眼睑、口角边缘、趾部）73小结•寄生虫、癣菌等检查时，只要在镜检见到相应的虫卵、癣菌等即可认定；而细胞学检查则需要在熟悉正常细胞的基础上，在显微镜下找到异常细胞来诊断•实验室检查很重要，会有你想不到的结果74