过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)

1过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）一、原理过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2→H2O+O2），从而降低了过氧化氢的毒害作用。土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高锰酸钾滴定法。二、试剂（1）2mol/LH2SO4溶液:量取5.43ml的浓硫酸稀释至500ml，置于冰箱贮存;（2）0.02mol/L高锰酸钾溶液：称取1.7g高锰酸钾，加入400mL水中，缓缓煮沸15min，冷却后定容至500mL，避光保存，用时用0.1mol/L草酸溶液标定；（3）0.1mol/L草酸溶液：称取优级纯H2C2O4▪2H2O3.334g,用蒸馏水溶解后，定容至250ml；（4）3%的H2O2水溶液：取30%H2O2溶液25ml，定容至250ml，置于冰箱贮存，用时用0.1mol/LKMnO4溶液标定。三、操作步骤2（1）分别取2~5g土壤样品于具塞三角瓶中（用不加土样的作空白对照），加入0.5mL甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。（2）取出，立刻加入25mL冰箱贮存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于冰箱中放置1h。（3）取出，迅速加入冰箱贮存的2mol/LH2SO4溶液25mL，摇匀，过滤。（4）取1mL滤液于三角瓶，加入5mL蒸馏水和5mL2mol/LH2SO4溶液，用0.02mol/L高锰酸钾溶液滴定。根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KMnO4。过氧化氢酶活性以每g干土1h内消耗的0.1mol/LKMnO4体积数表示（以mL计）表示。四、结果计算（如下面处理）：KMnO4标定：10mL0.1mol/LH2C2O4用KMnO4滴定，所消耗KMnO4体积数为19.49mL，由此计算出KMnO4标准溶液浓度为0.0205mol/L。H2O2标定：1ml3%H2O2用KMnO4滴定，所消耗KMnO4体积数为16.51ml,由此计算出H2O2浓度为0.8461mol/L。酶活性=（空白样剩余过氧化氢滴定体积—土样剩余过氧化氢滴定体积）*T/土样质量其中：酶活性单位：ml(0.1mol/LKMnO4)/(h·g)；T-高锰酸钾滴定度的矫正值T=0.0205/0.02=1.026。五、注意事项31、用0.1mol/L草酸溶液标定高锰酸钾溶液时，要先取一定量的草酸溶液加入一定量硫酸中并于70℃水浴加热，开始滴定时快滴，快到终点时再进行水浴加热，后慢滴，待溶液呈微红色且半分钟内不退色即为终点。2、高猛酸钾滴定过程对酸性环境的要求很严格。经探究后发现直接取1mL滤液滴定不仅液体量太少，终点不好把握，硫酸的量也不足，因此我组对实验方法进行了改进，即取1mL滤液于三角瓶，加入5mL蒸馏水和5mL2mol/LH2SO4溶液，再用高锰酸钾溶液滴定，这样滴定过程极为方便。