土壤蔗糖酶活性测定(3-5-二硝基水杨酸比色法)

土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖；pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成；甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。三、操作步骤（1）标准曲线绘制分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取5g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样）。四、结果计算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m其中：a样品、a无土、a无基质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重。