HPLC-ICP-MS联用技术-李柏

利用HPLC-ICP-MS研究生物样品中的微量元素喻宏伟王萌李柏中国科学院高能物理所核分析室中国科学院核分析重点实验室(北京)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）主要内容反相离子对色谱与电感偶合等离子体质谱联用生物样品中Se的种态研究生物样品中无机和甲基汞的测定排阻色谱与电感偶合等离子体质谱联用生物样品中金属蛋白测定2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）RP-IP(Se)引言硒是一种重要的人体必需微量元素，硒的生物功能与其化学形态和含量密切相关，因此要全面研究硒的生物学意义，种态分析十分必要。2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）RP-IP(Se)引言硒在生物和环境样品中含量极低，所以对分析的灵敏度和精确度的要求很高，联用技术被认为是进行化学种态分析的有效手段，其中高效液相色谱（HPLC）与电感耦合等离子质谱（ICP-MS）联用作为一种高灵敏的元素种态分析方法得到广泛的应用。2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）ICP-MS因其超高的灵敏度成为元素选择性分析的有效手段，而且液相色谱和ICP-MS联用在具备标准物质的情况下，对已知结构的硒化合物有很好的分析效果。RP-IP(Se)引言2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）仪器和方法试剂１．标准物质硒酸钠（Na2SeO4）高纯AlfaAesar公司亚硒酸钠（Na2SeO3）分析北京中联化工厂硒代胱氨酸（selenocystine,SeCys）硒代胱胺（selenocystamine，SeCM）硒代蛋氨酸（selenomethionine,SeMet）Sigma公司硒代尿素(Selenourea，SeUr)Fluka公司三甲基硒离子（Tri-methylSelenoniumiodide，TmSeI）(本实验室合成)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）仪器和方法试剂2.流动相甲醇色谱纯天津四友离子对试剂七氟丁酸Fluka公司所有溶液均用18.2MΩ超纯水配置,并用0.22u微孔滤膜过滤2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）仪器和方法色谱系统:Waters626非金属流路四元泵Waters600S控制器Waters2487紫外检测器质谱系统:ThermoElementalX7系统连接:色谱和质谱连接采用PEEK管直接连接,利用色谱手动进样器触发做为质谱收集开始.2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）仪器和方法仪器条件HPLC：Waters5μmSymmetryShieldRP18反相柱（3.9×150mm）SymmetryShieldRP18保护柱（3.9×20mm）流动相0.1％HFBA，含甲醇0.3％和2％（v/v）流速1.0ml/min进样量50μL柱温，室温，ICP-MS：射频功率1200W采样深度100mm冷却气流速13.0L/min驻留时间500ms辅助氩气流速0.8L/min测量同位素78Se，80Se，82Se雾室载气流速，0.8L/min分析时间1800SCCT模式：氦氢混合气组成，He-H27.28％H2（v/v）氦氢混合气流速，7.5ml/min2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）仪器和方法样品制备:人肝细胞胞质溶液通过匀浆,差速离心获得.存于-70度深低温冰箱.分析前通过离心浓缩装置截取分子量小于3000的组分用于分析.采自自愿健康人血清除去高分子量组分后进行分析测量.健康人尿样用色谱流动相稀释后分析测量.分析用的流动相、样品均用0.22u微孔滤膜过滤.2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论CCT技术用于分析测量:不同测量元素之间灵敏度比较0510152025300100002000030000SeCysSeUrSeMetSeCMTmSeINa2SeO3CountsTime(min)78Se80Se82SeNa2SeO42020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论CCT技术用于分析测量标准模式和碰撞技术比较标准和碰撞计数比较(Se80/Se82)0500010000150002000025000300000.05.010.015.020.025.0时间(min)计数(CPS)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论CCT技术优点：消除干扰，提高灵敏度，降低检出限。2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论１、5、10、50、100ng/ml标准溶液谱1-100PPb标准谱（Se-80)01000020000300004000050000600000.010.020.030.040.0时间(min)计数(CPS)Se(IV、VI）SeCysSeUrSeMetSeCM2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论标准曲线线性七种Se小分子浓度在1、5、10、50、100ug/L五点标准曲线线性关系良好。r：0.997-1.000之间020406080100050001000015000SeO42-SeO32-TMSe+SeCysSeUrSeMetSeCMCounts(Area)Concentration(g/L)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论联用技术测定性能评价：在5次测量情况下保留时间、分配比、分离度、检出限、定量线硒酸钠亚硒酸钠三甲基硒硒代半胱氨酸硒代尿素硒代甲硫氨酸硒代胱胺（Tr）1.682.002.633.948.5814.2527.44（RSD）0.712.640.442.091.542.552.76（K）0.000.190.561.344.097.4615.29（RSD）9.653.453.291.942.772.97（R）00.550.715.7319.5118.3125.82（LD）0.310.331.480.050.100.090.31（LOD）1.031.114.930.180.330.291.032020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结果和讨论生物样品原样和加标结果:（标准加入回收率97%-117%）02468101214303502004006008001000originalspikedCountsTime(min)SeO2-4SeO2-3TmSeISeCysSeUrCytosolicExtracts0530350500010000originalspikedSeO2-3CountsTime(min)SeO2-4Serum02468101214303505000100001500020000SeMetSeUrSeCysTMSeIoriginalspikedCountsTime(min)SeO32-Urine2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）结论研究中发展的HPLC-ICP-MS联用技术使硒种态分析的的检出限除TmSeI外均低于ppb数量级，并在1－100μg/L范围内线性良好。各化合物之间，尤其是硒代氨基酸之间有满意的分离效果，重现性很好。各种生物样品只需简单处理即可直接应用于联用分析，样品用量少，分析结果可靠。2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析仪器和方法试剂：氯化甲基汞（纯度≥98%，Riedel-deHaën公司，德国）；氧化汞（光谱纯，Merck公司，德国）。标准溶液：CH3HgCl和HgO用10%(v/v)HNO3配成浓度为1000mgHg/L储备液，用棕色瓶保存于4℃冰箱中备用。在实验当天用去离子水逐级稀释使用。其它均为国产试剂2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析仪器和方法仪器：HPLC:Waters626非金属流路四元泵Waters600S控制器WatersSymmetryShieldRP18Column（5μm,3.9mm×150mm）ICP-MSThermoElementalX7连接方式:用PEEK管直接连接2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析仪器条件ICP-MS射频功率载气采样深度泵速*雾化器雾室温度驻留时间测量同位素1200W0.81L/min93mm20rpm同心concentric1℃0.2s202HgHPLC流动相流动相流速进样环5％(v/v)CH3OH1mL/min50μLPEEK（0.06mol/LNH4AC，0.1％HSCH2CH2OH2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析仪器和条件样品处理准确称取0.2g样品于15mL离心管中，加入3mL5mol/LHCl，超声波提取30min后，3000rpm离心10min，收集上层溶液。上述提取过程再重复一次，合并提取液。氨水调节pH值至3-7，用去离子水稀释、定容，0.45μm滤膜过滤备用。2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析1、5、10、20ug/l标准曲线02000400060008000100001200014000051015时间（min）计数（CPS）结果和讨论标准曲线系列谱(线性回归系数R0.999)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析结果和讨论人发标参(GBW07601)测量谱020040060080010000100200300400500Hg2+MeHg+CountspersecondTime(s)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析结果和讨论对虾标参(GBW08572)测量谱02004006008001000020040060080010001200140016001800CH3Hg+CountspersecondTime(s)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析结果和讨论鱼样标参(IAEAMA-B-3/TM)测量谱02004006008001000050010001500200025003000CH3Hg+CountspersecondTime(s)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析结果和讨论牛肝(GBW080193)测量谱图020040060080010000100200300400500600Hg2+CountspersecondTime(s)2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）标准参考物中无机和甲基汞的分析标准参考物测定结果样品名甲基汞无机汞总汞总汞标准值甲基汞文献值人发146±6203±27349±23360±50180±50对虾178±5ND**178±5201±4180±10牛肝ND**167±12167±12180***——鱼434±2149±8483±25510±70420[22]注:表中数值单位为ug/LND:为未测出2020/5/26中科院高能物理所核分析室中科院核分析重点实验实验室（北京）排阻色谱联用技术