搜索
一、基因工程三大工具1、限制性核酸内切酶——剪刀①定义：可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶②来源：主要从原核细胞中分离③作用结果：产生黏性末端或平末端黏性末端平末端思考1：①若想获得一个特定性状的基因，必需要用限制酶切几个切口？产生几个黏性末端②把两种来源不同的DNA用一种限制酶切割，产生的黏性末端会怎样呢？2、DNA连接酶——针线①定义：能将限制酶切割产生的黏性末端之间的缝隙“缝合”起来②特点：无特异性3、运载体①种类：原核生物的质粒，噬菌体，动植物病毒②运载体必须具备以下条件：DNA分子能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有多个限制酶切位点，以便与外源基因连接具有某些标记基因，便于进行筛选，如抗性基因等具有复制起点和启动子③常用的运载体——质粒：小型双链环状DNA分子二、基因工程流程1.获取目的基因通常有以下几种方法获取目的基因：①从细胞中直接分离②人工合成：反（逆）转录法；根据已知氨基酸序列合成相应DNA2.目的基因与运载体重组①用相应的限制酶切割目的基因及载体，②将具有相同末端的目的基因和载体用DNA连接酶连在一起，形成重组DNA分子思考2：向用同一种限制酶处理后的目的基因和质粒混合物中加入DNA连接酶，最终得到的重组DNA分子有几种？请用图示表示3.导入受体细胞①将重组子导入受体细胞②常用的受体细胞有：大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌等③方法：导入植物细胞：农杆菌转化法（转基因抗虫棉用的是花粉管通道法）；导入动物细胞：显微注射技术（注射入受精卵中）；导入原核生物：一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。4.筛选含目的基因的受体细胞三、限制酶的选择首先所选用的酶在目的基因和质粒上都有酶切位点，一看目的基因：目的基因要切完整二看质粒：①要保留至少一个标记基因②复制起点和启动子（如果图上有）不能切③所切位置必需在复制起点与终点或者启动子与终止子之间三看重组子：有些题目要求目的基因要与质粒高效连接例1、（2019年松江一模）生物技术及生命科学的应用。（13分）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。1、转基因技术中通常用图1中质粒作为载体，质粒的本质是。2、用图1中质粒和图2目的基因构建重组质粒，应选用两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过酶作用后获得重组质粒。3、若BamHI酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为例2、（2019年静安一模）生物工程（12分）研究发现，利用抗体抑制肿瘤细胞表面的CD47蛋白的活性，可促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。为制备抗CD47抗体，研究人员先利用基因工程方式制备CD47蛋白，图5为含CD47基因的外源DNA、质粒DNA的有关信息，EcoRI、BamHI、SalI、XhoI均为限制酶，Kanr、Tcr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。1.（2分）为了形成合适的重组质粒，应该选用限制酶________切割外源DNA和质粒DNA。A．EcoRI和XhoIB．BamHI和XhoIC．EcoRI和SalID．BamHI和SalI例3、（2019青浦一模）回答有关基因工程与微生物的问题。（12分）利用微生物分解废纸是一种环保的方式，但废纸中的纤维素分子量大不能直接进入酵母菌，且酵母菌无法分解利用环境中的纤维素。为解决这一难题，科学家将纤维素酶基因通过重组质粒导入酵母菌。其所用质粒及其酶切位点如图16，外源DNA上的纤维素酶基因及其酶切位点如图17。1.（2分）图17中的纤维素酶基因作为________________，质粒作为________________。2.（2分）为使纤维素酶基因能够与质粒有效组合，应选用最合适的限制酶是_____________A.BamHI和PstIB.HindIII和PstIC.PstID.BamHI和HindIII3.（2分）若质粒被HindⅢ限制酶识别的序列是-AAGCTT-，并在A与A之间切割。请画出被切割后所形成的黏性末端。例4、（2019年崇明一模）（2分）基因编辑技术所使用的CRISPR/Cas9系统需要对特定的DNA序列识别并切割，其功能类似于基因工程工具酶中的。例5、（2019年金山一模）生物技术及生命科学应用(10分)严重联合性免疫缺陷症是一种T淋巴细胞缺乏腺苷脱氨酶（ADA）引起的疾病，通过基因工程的方法将正常ADA基因导入患者细胞中进行治疗。图17分别表示正常ADA基因、金属硫蛋白基因（含有该基因的细胞能在含重金属镉的培养基中生长）和质粒（总长为3.8kb，1kb=1000对碱基），ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ均为限制酶。1.（2分）为了筛选含有目的基因的受体细胞，需要先将目的基因和标记基因连接形成融合基因。首先用限制酶切割正常腺苷脱氨酶基因与金属硫蛋白基因，然后用DNA连接酶将它们连接形成融合基因。2.（2分）将上述融合基因与图17中的质粒构建成重组质粒时，应选用的限制酶是。A．ClaⅠB．SacⅠ和XbaⅠC．ClaⅠ和XbaⅠD．ClaⅠ和SacⅠ例6、（2019年长宁一模）图17示基因J所在的DNA片段，图18示质粒的部分碱基序列。（现有4种限制酶：MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、EcoRⅠ，能识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、G↓AATTC）。1.（2分）据图17、18分析，过程④（形成重组DNA分子）中不能（宜）使用的限制酶有（多选）。A.MspⅠB.BamHⅠC.MboⅠD.EcoRⅠ例7、（2018年宝山二模）回答下列关于遗传信息的表达和生物工程问题（12分）图11为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图12表示质粒，图13表示目的基因上的DNA片段，图14表示目的基因及限制酶切点。请回答下列问题：1.图11中限制酶EcoRⅠ的特点是。2.（2分）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是。课堂作业1、（2018年奉贤二模）回答下列有关转基因技术问题（12分）利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因（G）整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。图14和图15所示分别为实验所用的质粒上相关酶切位点以及含绿色荧光蛋白基因（G）的外源DNA片段上具有的相关酶切位点。（1）基于上述信息，该基因工程的目的基因是。（2）用图14中的质粒和图15外源DNA构建重组质粒，不能使用__________切割，原因是__________________________________。如果要防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，则应选择下列方法_______(填编号)为好。①只使用EcoRI处理②使用BamHI和SmaI同时处理③使用BamHI和HindIII④使用SmaI和HindIII同时处理2、（2018年虹口二模）回答有关现代生物技术应用的问题（10分）。乳糖不耐受是由于乳糖酶（LCT）分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻。我国利用生物技术培育出转基因低乳糖奶牛新品种，给患乳糖不耐症患者带来福音。图18为转基因低乳糖奶牛培育流程。图19是使用限制酶BamHⅠ切开DNA产生的结果。（1）（2分）据图19分析，BamHⅠ的识别序列以及切割位点（用“↓”表示）是____________3、（2018年黄埔二模）生物技术及生命科学的应用（12分）。普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐贮藏。科学家将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。目的基因和质粒（含卡那霉素抗性基因KmR）上有PstI、SmaI、HindⅢ、AluI四种限制酶切割位点。操作流程如图16所示。（1）（2分）本实验中的目的基因是。（2）（2分）在构建重组质粒时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了确保目的基因与载体进行高效拼接，在此实例中，应该选用限制酶是(多选)。A．PstIB．SmaIC．AluID．HindⅢ答案：思考2如下图例1：（1）小型双链闭环的DNA分子（2）BclI和HindⅢ（2分）DNA连接（3）例2：（1）B例3：（1）目的基因运载体（每空1分，共2分）（2）B（2分）（3）例4：限制酶例5：（1）ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ（2）B例6：ACD例7：（1）特异性地识别GAAATTC和切割DNA中鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸之间的键（特异性识别和切割DNA分子）（2）选择的限制酶是PstⅠ、EcoRⅠ1、（1）绿色荧光蛋白基因／G基因（2）ＳmaIＳmaI限制酶会破坏目的基因和质粒中的抗性基因／标记基因（２分）③2、G↓GATCCCCTAG↑G3、（1）抗多聚半乳糖醛酸酶基因（2）AB