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LC-MS/MS优化技巧李立军2003.2BEIJING样品制备•样品处理的好坏直接关系到整个LC-MS分析的成败，必须要有成熟规范的样品制备方法。•样品预处理各步不能随意省略,如萃取、分离、去盐等。某些化合物必须化学衍生化以适应LC-MS要求，如磷酸酯水解。•若MS信号实在太低,考虑换另外的样品处理方法。•浓度非常低的样品不能保存太长时间,容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，标准品工作液现配现做.选择离子化方法•根据样品性质确定离子化方式:高极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合ESI(IS)。•弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI（HN）。ESI不行的：极端非极性化合物如苯等;APCI不行的：非挥发性样品;热稳定性差的样品。选择离子化方法•碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能正负都要做,有些化合物正负都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用正离子方式试。LC条件的选择•根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水，某些化合物只有某种流动相体系才出峰。一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些，通常有机相比例高些好。•梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，如恒定比例流动相能满足分离要求时，尽量不用梯度，尤其定量分析时。LC条件的选择•流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率，但是否加酸不是绝对的，还要根据LC的分离情况，样品在酸性条件下的稳定性等决定。通常PH值低些[M+H]+比率高，PH值高些[M+Na]+、[M+K]+或[M+NH4]+比率高。LC条件的选择•定性分析时，有时加一些NH4+，Li+等,可帮助确定判断母离子，对碎片较少化合物可增加质谱特征性，但会使生物大分子的质谱复杂化。•水的选择：娃哈哈纯净水比普通蒸馏水强，若在玻璃瓶中已存放时间太长，有可能变质，使本底增大，LC压力增高，换新水。LC条件的选择•溶解样品的溶剂：用流动相或甲醇、乙腈溶比用含水多的溶剂LC峰系形好。如果常用的流动相不能很好溶解样品，可用少量特殊溶剂先将样品溶解后再用流动相稀释。•LC流量在色谱柱和MS允许情况下适当高可以压缩峰宽，使峰强度提高。•当只有粗色谱柱，只能大流量时可采用三通分流，以适应MS的流量要求。LC条件的选择•选细色谱柱，如内径2mm，进样量可以小，提高相对浓度，离子化效率，灵敏度。•换长些的色谱柱，对定性分离效果好，但分析时间延长，如峰形仍不理想，可考虑另选其他型号色谱柱。•柱后补偿：当不得不用高浓度TFA时，常用异丙醇,解决信号抑制问题。柱后衍生化，增加离子化。调机准备•仪器平衡时间：真空，温度，LC流动相比例，宁可长些。•容器注意，塑料离心管添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时，干扰物信号有可能超过待测物。•LCPUMP脱气，先放掉柱前部管路中液体,排净气泡，还要注意储液瓶液面高度。仪器参数的优化•CAL先校准，用PPG或一已知化合物检验，如偏差不大，可以不用做质量校准，但偏高偏低要心中有数。•先用浓度大约0.1-1ppm的标样，通过syringepump，以5-10ul/min优化COMPOUND项下面的参数，如DP，CE，EP，CXP及CAD等。•顺序：Q1SCAN–PRODUCTIONSCAN–MRM。仪器参数的优化•不同化合物参数有可能差别很大。•再接通LC用FIA优化其他参数及源位置,或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时LC保持需要的流量，优化温度和GAS1及2，CXP,CAD,EP优化后通常不用再改，在保证充分样品离子化基础上，DP低些使母离子丰度提高,总灵敏度相应提高。仪器参数的优化•质量范围不要太宽，涵盖待测离子再增加20-30AMU即可。•采样时间适当长些噪声低，当同时检测数十对离子时，MRM采样时间可以数十毫秒.同时检测数对离子时，可100-200毫秒。仪器参数的优化•母、子离子输入的质量数值要选准,要根据Q1SCAN及PRODUCTIONSCAN得到的结果输入，不能只是整数。当不能确定精确质量数时，可选待测质量数上下各0.1AMU，同时数对离子优化，最终找出灵敏度最佳的一对离子。例如321.0-152.0，321.1-152.0，320.9-151.9…。•若样品较杂，同一化合物要选择几对母、子离子，经进样实验找出哪对有干扰，去掉，保留不易受干扰的1-2对离子。仪器参数的优化•每对离子各参数分别设，如DP，CE，TIME等，对较弱离子对，采样时间可适当长些。•手动运行RAMP各参数分别优化比一次AUTO好，STEP选小些更准，范围不用太宽，每次优化重复两次以上防偶然误差。仪器参数的优化•根据LC流量和流动相组成确定温度和GAS1及GAS2，当流量大，水相多时，温度及气流要大。离子源喷雾位置是根据LC流量调节的，基本上流量固定位置就固定。•调节喷雾电压，但太高有可能放电。•调节Q1及Q3分辨率。•许多源参数互相影响，需要反复细调,使信噪比得以改善。清洗•做完含生物体液样品后，LC需多冲些时间，使吸附到色谱柱上的干扰物完全洗脱下来。•若本底高，清洗离子源喷雾针管和oriface，喷雾针可拆下超声清洗，oriface要用无毛纸沾溶剂擦。•清洗管路，可从源上拆下PEEK，或将源从仪器上取下，用SYRINGEPUMP洗，换不同溶剂，极性、非极性、酸等轮番冲洗，最后甲醇/水。清洗•清洗进样针，阀等。•用过含酸的流动相后，色谱柱，离子源都要用甲醇/水冲，延长仪器寿命。•做完MRM后，用手动使仪器处于Q1SCAN，降温，停大流量LC，最后关气，但管路中最好有些水，不要完全干。其他可用方法•做纯标样分辨率可母、子离子都选LOW，S/N提高一倍，而噪声并不增高，若复杂混合物，有基质干扰不宜选LOW。•适当加大进样量。•浓缩样品，测定后再推算回原始浓度。•谱图平滑后可提高信噪比，可多次平滑。•零级空气的选用，负离子比氮气灵敏度提高。•提高检测器电压。•当化合物很稳定不易产生碎片，可考虑采用Ar、Xe等原子量较大的气体，以增加碰撞能量。