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临床本科毕业论文范文题目：红芪多糖的纯化及初步结构鉴定论文摘要：目的研究红芪多糖的分离纯化及初步的结构。方法采用超声辅助提取多糖，比较Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白的效果，并用GC、TLC及IR分析多糖的初步结构。结果三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白，经SephadexG-25柱层析分离纯化后得红芪多糖2(HPS-2)，HPLC确定为均一多糖，糖含量为98.2%，糖组成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为.3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。结论HPS-2是一种以β苷键为主的吡喃型杂多糖。论文关键词：红芪多糖;薄层色谱;结构鉴定红芪(RadixHedysari)，为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌。红芪中含有氨基酸、有机酸、β-谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物活性物质[1]。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用[1，2]。特别是我们近几年的研究发现，经7%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显。由于多糖为大分子化合物，分离纯化比较困难，而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之一，为了提高多糖的得率、纯度及活性，本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究，结合TLC、GC、IR等方法对HPS-2的结构进行了初步的分析，以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础。1材料与仪器红芪，购自甘肃武都;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-25(西安周鼎国生物技术有限责任公司);单糖对照品(中国药品生物制品检定所);SephadexG-25(上海长征制药厂);硅胶G(青岛海洋化工厂);其它试剂均为分析纯。CR22GⅡ型离心机(日本日立);UV-17型紫外仪(日本岛津);GC-Clarus5型气相色谱仪(美国PerkinElmer公司);红外光谱仪(NicoletNEXUS67);BS-1A自动部分收集器、HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司);美国Waters6型高效液相色谱仪，配Waters2414型示差折光检测器。2方法2.1红芪多糖的提取纯化路线其流程如下。2.1.1提取红芪药材→粉碎→超声脱脂→热水提取3次→合并提取液→减压浓缩后离心→取上清液→乙醇沉淀→有机溶剂洗剂→透析→减压浓缩→冷冻干燥得粗多糖HPS。2.1.2纯化粗多糖液→脱蛋白、色素→SephadexG-25柱层析→洗脱液透析→浓缩→冷冻干燥→精制红芪多糖HPS-2。2.2蛋白质和多糖含量的测定蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法[3]，多糖含量采用苯酚-硫酸法[4]。2.3脱蛋白方法称取一定量的粗多糖，加入适量蒸馏水，6℃加热溶解，备用。本实验采用3种脱蛋白的方法。2.3.1Sevag法取粗多糖溶液，加入等体积的氯仿-正丁醇(V/V为4∶1)试剂，混合振摇3min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。2.3.2三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液体积.1倍量的三氯乙酸，低温(4℃)剧烈振摇3min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。2.3.3三氯乙酸-正丁醇法取粗多糖溶液，加入等体积的三氯乙酸-正丁醇(V/V为1∶1)试剂，振荡1min，静置分层，收集下层水溶液，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。2.4红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖，溶解于适量蒸馏水中。过氧化氢除色素，减压浓缩，经醇沉、离心、冷冻干燥得红芪多糖1(HPS-1)，取适量的HPS-1，蒸馏水溶解后，SephadexG-25柱分离，蒸馏水洗脱，流速.8ml/min，每3ml收集1份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并主峰流出液，减压浓缩至一定体积，冷冻干燥得HPS-2。2.5纯度鉴定用HPLC法，TSK-gelG25PW色谱柱，示差折光检测器，流动相为双蒸水，流速1.ml/min，检测器温度35℃，样品浓度4mg/ml，进样量5μl。同时取该样品溶液在2～4nm范围内进行紫外扫描。2.6气相色谱参照文献[5]，多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物，以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行GC分析。色谱条件:OV-11毛细管柱(5m×.32mm)，载气为N2，流速5ml/min，分流比4∶1，FID氢火焰检测器，汽化室温度25℃，检测器温度28℃。程序升温:11℃(保持5min)→(5℃/min)→28℃(保持2min)。进样量.4μl。2.7薄层色谱[6]取15mgHPS-2，三氟醋酸彻底水解，水解产物溶于1ml蒸馏水中，以标准单糖为对照，分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样，上行二次展开，展开剂:醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V);自然风干后显色，显色剂:苯胺-邻苯二甲酸溶液，烘箱中15℃加热5～1min显色。2.8红外光谱测定取2mgHPS-3，KBr压片，测定红外光谱。3结果3.1脱蛋白方法的选择以蛋白脱除率和多糖损失率为指标，比较Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白效果(见图1)。Sevag法的多糖损失率最低，但脱蛋白率也最低;三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白率最高，多糖损失率最低;三氯乙酸法的脱蛋白率达3%以上，但多糖损失最高。综合各方面的因素，本实验选取三氯乙酸-正丁醇法脱除红芪多糖中的蛋白质。3.2红芪多糖分离纯化红芪多糖经SephadexG-25柱层析纯化分离的洗脱曲线(见图2)。仅出现1个洗脱峰，收集主峰，透析，浓缩，冷冻干燥，得到HPS-2。3.3纯度鉴定HPS-2的紫外扫描在26～28nm处吸收峰消失，茚三酮反应呈阴性，说明样品中的蛋白质基本除尽，也无核酸存在;碘-碘化钾反应呈阴性，表明样品为非淀粉多糖;经HPLC凝胶色谱后为单一对称峰。表明其为均一组分;苯酚-硫酸法测定HPS-2的糖含量为98.6%。3.4红芪多糖的结构分析3.4.1气相色谱分析气相色谱分析(见图3)。比较标准品和样品的保留时间，可见多糖HPS-2由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成。其摩尔组成比例为.3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。3.4.2薄层色谱分析HPS-2经薄层色谱(见图4)。检出半乳糖(Rf对=Rf样=.4)、葡萄糖(Rf对=Rf样=.3)、阿拉伯糖(Rf对=.2，Rf样=.19)、木糖(Rf对=Rf样=.62)和鼠李糖(Rf对=Rf样=.77)，其中木糖和鼠李糖含量较低，斑点不明显。这与气相色谱结果一致。3.4.3红外分析从IR谱图由图5可见，HPS-2在36～32cm-1、3～28cm-1和14～12cm-1处均具有多糖的特征吸收峰。1154、18、124cm-1处为β-吡喃糖基的振动峰[7];898cm-1为β-糖苷键的吸收峰，82cm-1处为α-吡喃糖的吸收峰，说明多糖HPS-2中存在α和β两种类型的苷键，并以吡喃型糖为主。4结论本实验比较了3种脱蛋白方法，三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白效果最好，脱除率达37.2%，多糖损失率少。利用葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析分离纯化红芪多糖得HPS-2，经HPLC及紫外扫描为均一多糖，不含蛋白质和核酸。GC、TLC及IR分析HPS-2的糖基组成和结构为，主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为.3∶.2∶2.7∶16.1∶2.，单糖主要为吡喃糖，异头碳以β型为主，并有少量的α型。这为红芪多糖的深入研究打下了理论基础，特别为其组成的快速分析提供了可靠的方法。参考文献[1]权菊香.红芪的药理研究进展[J].时珍国药研究，1997，8(2):178.[2]金智生，汝亚琴.中药红芪的实验研究进展[J].甘肃中医学院学报，23，2(4):52.[3]李知敏，王伯初，周菁，等.植物多糖提取液的几种脱蛋白方法的比较分析[J].重庆大学学报，24，27(8):57.[4]董群，郑丽伊，方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志，1996，31:55.[5]康学军，曲见松.白芷多糖中单糖组成的气相色谱分析[J].药物分析杂志，26，26(7):891.[6]张维杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社，1987:1.