《多酚氧化酶》PPT课件

第10章多酚氧化酶一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧氧化还原酶,EC1.10.3.1)一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(对苯二酚氧化酶laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。1、多酚氧化酶的名称2、植物中多酚氧化酶分布多酚氧化酶是植物中最受注意的一种酶,在葡萄,洋李,无花果,枣,茶叶和咖啡豆中含量很高,它在这些果实中起着人们期望的作用.多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕和莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实起着不需宜的作用,易引起褐变,造成变质和腐烂,对于新鲜果实的保藏带来极大困难胡椒中不存在多酚氧化酶.存在:植物、果蔬的叶绿体、线粒体,马铃薯块茎分布广泛多酚氧化酶在植物中的含量随品种不同而有很大变化，在众多的水果和蔬菜中，橄榄中的多酚氧化酶活力最高。多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的成熟度。在绿叶中，很大一部分酶活力集中在叶绿体中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞中；在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差别很大，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。二、多酚氧化酶催化反应及其作用底物1.催化反应多酚氧化酶是一种加氧酶，它催化酚的选择性羟基化，羟基化产物继续氧化生成邻-苯醌。多酚氧化酶的作用下氧化形成不稳定的邻-苯醌类化合物,然后再进一步通过非酶氧化反应,聚合成黑色素(melanin)。羟基化氧化反应多酚氧化酶多酚氧化酶R=H-,Me-,MeO-,HO2C-(CH2)2-,HOCH2-,HO(CH2)2-,PhCONHCH2-H2O有机溶剂维生素C聚合物OHROHROHO2H2OO2H2OOOR多酚氧化酶的作用导致香蕉,苹果,桃,马铃薯,蘑菇,虾发生非需宜的褐变和人的黑斑形成然而对茶叶,咖啡,葡萄干和梅干,以及人的皮肤色素形成产生需宜的褐变当邻苯醌与蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基反应,可引起蛋白质的营养价值和溶解度下降,同样由于褐变反应也将会造成食品的质地和风味的变化。热带水果50%以上的损失都是由于酶促褐变引起的.同时酶促褐变也是造成新鲜蔬菜例如莴苣和果汁的颜色变化,营养和口感变劣的主要原因控制果蔬加工和贮藏过程中酶促褐变,例如驱除O2和底物酚类化合物以防止褐变,或者添加抗坏血酸,亚硫酸氢钠和硫醇类化合物等,将初始产物,邻苯醌还原为原来的底物,从而阻止黑色素的生成.还原剂都能直接引起酶失活,从而抑制酶促褐变.这是因为抗坏血酸能够破坏酶活性位点上的组氨酸残基,而亚硫酸氢钠和硫醇可以除去酶活性位点中的Cu2+4-己基间苯二酚,苯甲酸和其他一些非底物酚类化合物,也可作为多酚氧化酶的有效竞争性抑制剂2.作用底物水果、蔬菜中底物为：一元酚类邻二酚类（对位二酚也可）（间位二酚不作底物）如：水果中的儿茶酚OHOH土豆中的酪氨酸HOCH2CHCOOHNH2重要的天然底物三、pH和温度对多酚氧化酶活力影响1.pH对酶活力的影响(1)适宜pH：4～7(2)不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的多酚氧化酶，也有不同的最适pH(3)果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶,最适pH也有差异(4)酶的提取或分离的方法对它的最适pH也有影响(5)测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适pH也有影响(6)大多数多酚氧化酶只有一个最适pH,在一些情况下,有第二个最适pH2.温度对多酚氧化酶活力影响不同种类、品种、部位的多酚氧化酶有不同的热稳定性，通常最适温度在常温加热易使酶失活同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的热稳定性低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活性下降比较缓慢四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂和果蔬酶促褐变的防止1.激活剂多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体的寡聚体，激活剂的作用是使酶蛋白以一定的聚合度存在，才有生物活性。SDS、Cu2+、酸、尿素等2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止酶促褐变:较浅色的水果、蔬菜在受到机械性损伤（削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎）及处于异常环境变化（受冻、受热等），在酶促（催化）下氧化而呈褐色，称为酶促褐变西瓜、香瓜、桔子、柠檬无酚酶，不褐变。亚硫酸类是酚酶抑制剂。实例1：土豆的褐变实例2：含有儿茶酚水果的褐变褐变防止方法酶促褐变的三个条件，缺一不可。即：多酚类物质、酚酶、氧气除去多酚类物质困难，不现实。∴一般为降低酚酶活性、驱氧(1)加热钝化酶活性75～95℃、5～7S的加热处理，可使大部分酶活性丧失。常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌加工中，必须严格控制时间和温度。加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐变。微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风味。(2)螯合酶促作用的金属离子金属（铁、铜、锡、铝等）离子是多酚氧化酶的激活剂。Fe3+、Fe2+、Cu2+能促进褐变主要是因为铁和铜不仅能和酚类化合物反应形成褐色物质，而且能催化还原酮类的氧化。柠檬酸对Cu2+有螯合作用。EDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有关，有的效果则不明显。(3)酸处理法多数酚酶最适pH＝6～7，pH3失活(高酸性环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致PPO逐渐失活，酶活性趋于最低。)常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。实践证明：0.5%柠檬酸+0.3%抗坏血酸效果好。抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有还原剂的作用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，并通过自身氧化来减少体系的含氧量。抗坏血酸抑制酶褐变的机理（图）（4）酶活抑制剂亚硫酸类是酚酶抑制剂。常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠(Na2S2O4)如：在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。实验表明：10ppm可抑制酚酶活性，但有挥发损失，还与醛类加成等。实际应用300ppm，残留20ppm。在微酸性（pH＝6）时，抑制酚酶的效果最好。防止原因有三：a.抑制酶活性b.将醌还原为酚c.与醌加成，防止聚合(5)驱氧通过沸水烫漂、抽真空（93kPa，5～15min）、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包装设计等均可达到驱除食品内氧气的目的，从而抑制酶褐变的发生。控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等方法：用2%食盐+0.2%柠檬酸+0.06%偏重亚硫酸钠溶液作抽空液，在500mmHg的真空度抽空5～10min,可取得良好的护色效果。褐变的利用期望的褐变苹果酒、红茶发酵（生成茶红素）、可可粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶色素。红茶中含有三种酚性色素——茶红素、茶黄素和黄酮醇甙。五、多酚氧化酶的分子形式多酚氧化酶有多种分子形式原因：①类似的亚基不同程度的聚合；②不同亚基不同方式的结合;③酶蛋白质构象的改变;④前三种情况的结合。多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表现在底物特异性、最适pH、温度稳定性、对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的差别。六、多酚氧化酶活力测定多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两类①测定底物消失的速度②测定产物生成的速度——限于测定反应的初速度。PPO活性测定终点法多酚氧化酶催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌类反应，以儿茶酚为多酚氧化酶的底物，其氧化产物在416nm处有最大光吸收。测定系统：1.5ml20mmol/L邻苯二酚（溶于0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH缓冲液中，然后再加入0.1ml酶提取液，保温37ºC，三氯乙酸终止反应，并4000r/min离心5min，取上清液，适当稀释。以空白为对照，用分光光度计测定其在416nm波长下的O.D值。酶活性单位为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶量动态法PPO活性的测定取0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH缓冲液1.5ml于1cm比色皿中，加入1ml20mmol/L邻苯二酚溶液，PPO酶液0.5ml，混匀后在416nm处比色，酶液加入后开始记时，每30s记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率(ΔOD/t)计算酶活力。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶量。七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与PPO酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列膜系统实现的，受膜屏障的作用，这种区域性的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区域化分布破坏，PPO与酚类物质接近并与其发生化学作用，这将导致褐变。水果有更大的有着较弱薄片成分的细胞，冷藏时易发生细胞壁破裂，使PPO与酚类物质接触，产生褐变。1.苹果中多酚氧化酶引起苹果褐变的重要原因之一未成熟的苹果比成熟的更易褐变在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增加的2.梨中的多酚氧化酶梨多酚氧化酶仅作用于邻苯酚,与对苯酚、间苯酚和一元酚无作用以儿茶酚为底物,该酶的最适pH为6.5,在30℃活性最强.亚硫酸氢钠、维生素C、柠檬酸对梨中多酚氧化酶的抑制作用依次减弱,硫酸钠几乎无抑制作用不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧化酶特性.3.桃促使衰老的因素，可促进褐变，抑制衰老的因素可抑制桃果实的褐变桃低温下的褐变与逆境条件下不正常衰老有关酚类物质含量和PPO活性在果实近成熟时下降，所以适当延迟采收期可显著减少桃组织褐变的发生4.马铃薯马铃薯匍匐茎、块茎、花及根中的PPO活性明显强于叶和茎，而块茎外皮和花中子房及花药PPO活性也高于同器官的其他部位马铃薯中PPO的最适温度为30℃,在80℃处理5min,90℃处理2min,PPO活性基本丧失.考虑到马铃薯淀粉加热可能变性的特点,在加工中不宜采用热处理的方法防止褐变.马铃薯中PPO的最适pH为6.6,在pH6-7之间酶的活力较高,在加工中应尽量避开此pH范围,可采用pH4.5左右来加工.二巯基丙醇,亚硫酸钠,半胱氨酸,抗坏血酸对PPO活性具有强烈的抑制作用,能有效地防止PPO褐变引起的质量问题文献报道一种没有PPO活性的马铃薯已通过遗传工程的方法得到思考题简述酶促褐变的机理及其控制措施。