全血胆碱酯酶活性的测定

全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1.掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。2.了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。3.学会末梢血的采集。实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。实验步骤A样品管+0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min+1.0mL水37℃水浴30minC标准管1.0mL磷酸盐缓冲液37℃水浴5min+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minD空白管1.0mL磷酸盐缓冲液37℃水浴5min+1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。实验结果表1-1520nm波长下样品的吸光度样品编号ABCD吸光度0.2990.0030.5380.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得：Xs=7538.0299.0003.0538.0=3.149μmolXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；A：以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。②计算酶活性的相对值Y=10060.1149.3=197Y—酶活性的相对值，%；Xs—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)；Xc—正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min)讨论1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19±0.398μmol；因3.149μmol在3.19±0.398μmol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。2.各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导致胆碱酯酶活性变化有关。3.采血要迅速，防止凝固及氧化；振摇要充分，同时防止液体溅出；比色时有以D管调零。注意事项1.采血前应准备好试管，提前加入磷酸盐缓冲液；2.采血时严格消毒，用过的采血针放入利器筒中，棉签放入垃圾桶中，不可混放；3.准确控制水浴的温度和时间，否则会影响实验结果；4.加入三氯化铁显色后，20min内比色。