Superdex-10-300GL-预装柱配置及常见问题处理

Superdex10/300GL预装柱配置及常见问题处理1.购买预装柱时的配置Superdex10/300GL(17517401/17517501)建议购买FilterKit(18115311)+Filtertool(18115320)FilterKit是滤膜和密封圈的配件，当滤膜堵塞或者密封圈磨损漏液时更换。Filtertool是更换滤膜和密封圈时使用的工具。2.第一次使用或长时间保存后重新使用2.1小心移去层析柱顶端Storage/Shippingdevice和Stopplug，确保层析柱顶端接口充满溶液（Storage/Shippingdevice的使用方法参见附录4）。2.2确保连接层析柱的管线充满溶液，并以低流速(0.5ml/min)连接层析柱。2.3至少50ml去离子水平衡层析柱(0.5ml/min)，至少50ml洗脱液平衡层析柱(0.5ml)。2.4优先尝试的层析条件洗脱液：50mMphosphatebuffer,0.15MNaCl,pH7.0流速：0.5~0.75ml/min,roomtemperature上样体积：25μl(0.22μm滤膜过滤或10000g离心10min，Conc.10mg/ml)确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力(1.8MPaforSuperdex75，1.5MPaforSuperdex200)2.5经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用0.22μm滤膜过滤。3.层析条件优化3.1降低流速，提高高分子量蛋白分辨率，降低低分子量蛋白分辨率。3.2减少上样体积，提高分辨率。3.3改变有机溶剂浓度，改变选择性。3.4两根层析柱串联，提高分辨率，控制Superdex7510/300柱压小于3MPa，Superdex20010/300柱压小于2.5MPa。4.层析柱清洗4.1建议在层析柱清洗时采用反向流速。4.2用25ml0.5MNaOH或者0.5M乙酸清洗层析柱(0.5ml/min)。4.3立即用25ml去离子水冲洗层析柱，接着用至少50ml洗脱液清洗(0.5ml/min)。5.常见问题处理5.1层析柱反压升高或柱效下降。a确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。b按照4的方案清洗层析柱。c上样1CV1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠），室温过夜或37度1h，再按照4的方案清洗层析柱。d更换顶端滤膜topfilter（方法参见附录3）。e移去层析柱顶端2~3mm凝胶，调节adaptor消除顶端死体积（方法参见附录3）。5.2层析柱进气泡用80~100ml进行很好脱气的去离子水平衡层析柱（0.5ml/ml），气泡会被逐渐带出层析柱；很少量的气泡不会影响层析柱柱效（柱管内壁涂抹了一层塑料薄膜，小量气泡可能被吸附而不影响层析柱填料，而粗糙的表面不会影响层析柱柱效）。5.3层析柱漏液a确保是层析柱本身漏液，检查adaptorlock是否锁好。b更换密封圈O-ring（方法参见附录3）。5.4层析柱干裂a购买合适的装柱器（18115325），如果有两根以上的层析柱可只购买连接器（18115323）。b重新装填层析柱（更详细的信息参见Instructions28-4094-88AC）。5.5层析柱柱床胶面下降a确保不是由于不正当操作(超压、层析柱干裂、胶颗粒破碎等)造成的胶面下降。b长时间反向冲洗层析柱，观察胶面是否可以恢复。b调节adaptor消除顶端死体积（方法参见附录3），测定柱效或重复做之前做过的样品，如果柱效变化不大或者对于样品分离的效果影响不大，则继续使用；否则，建议重新装柱（参见5.4）。6.层析柱溶液兼容性6.1水相缓冲液pH3-126.2耐受8M尿素，6M盐酸胍6.3离子型和非离子型去污剂，30%乙腈，10%三氟乙酸，70%乙酸7.层析柱超过两天不用或长时间保存用2个柱体积脱气去离子水平衡，再用2个柱体积脱气20%乙醇平衡，并连接Storage/shippingdevice进行保存（Storage/Shippingdevice的使用方法参见附录4）。8.层析柱柱效测定方法附录1层析柱结构图附录2涉及配件的图片和货号FilterKit(18-1153-11)Filtertool(18-1153-20)Packingequipment10/100(18115325)Packingconnector10-10(18115323)附录3更换层析柱顶端密封圈和滤膜的方法(更详细的信息参见Instructions28409488AC)1.将层析柱和层析系统断开，并用堵头堵住层析柱底端。2.向上解开adaptorlock并移去adaptorunit3.用FilterTool小心从胶面上移去滤膜4.用水或洗脱液小心充满层析柱上端柱管，并小心搅起1~2mm胶面5.用水或洗脱液小心处理层析柱上端柱管，去除所有气泡6.放入一个已经预先浸湿好的滤膜（或更换O-ring到adaptor的正确位置）7.按照下图旋紧adaptorunit附录4Storage/Shippingdevice的使用方法1.如何移去Storage/Shippingdevice1.1向下按压spring-loadedcap1.2取出lockingpin1.3松开cap，旋开deveice2.如何充满Storage/Shippingdevice2.1用注射器按如图所示和device相连，注射20%乙醇到device中，使液面高于标线2.2敲出气泡，推动活塞至标线3.如何连接Storage/Shippingdevice3.1将层析柱下端用堵头堵死，层析柱入口和连接配件充满20%乙醇，然后连接Storage/Shippingdevice到层析柱顶端3.2调整spring-loadedcap高度并用lockingpin固定