药敏试验及CLSI标准更新-马筱玲

药敏试验及CLSI标准更新安徽省立医院检验科马筱玲药敏试验一般知识药敏试验•药敏试验定义：使用体外方法测定抗菌药物抑制病原微生物生长的效力。•主要目的：预测体内抗菌效果•评价参数：MIC(最低抑菌浓度)——在体外能够抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度。抗菌药物在体内的情况•不同给药方式，药物浓度不同（药物的吸收）•不同组织，药物浓度不同（药物的分布）•不同时间，药物浓度不同（药物的清除）•研究抗菌药物在体内吸收、分布和清除的动力学过程——药代动力学(PK)。•研究体内药物浓度与药物抗菌效果关系——药效动力学(PD)体外试验与体内情况有什么不同？体外：药物浓度固定不变T1/2βCmaxAUC体内：药物浓度随时间改变细菌MIC位于什么水平临床治疗有效？时间CmaxMICTMICCmax/MICAUC/MICAUCCmax/MICAUC/MICTMIC浓度MIC体外试验与体内情况的关联（PK/PD参数）各类抗菌药物PK/PD参数时间依赖性与时间有关，但抗菌活性持续时间较长对致病菌的杀菌作用取决于峰浓度抗菌作用与同细菌接触时间密切相关时间依赖且PAE或T1/2较长氨基糖苷类、氟喹诺酮类、酮内酯类、两性霉素B、daptomycin、甲硝唑多数β-内酰胺类、林可霉素类恶唑烷酮类、氟胞嘧啶链阳霉素、四环素、碳青霉烯类、糖肽类、大环内酯类、唑类抗真菌药Cmax/MIC10TMIC50%AUC/MIC125浓度依赖性药敏试验中抗菌药物的选择•自1998年以来卫生部将CLSI制定的药敏标准定为我国的部颁标准。依照（CLSI）所制定的药敏试验执行标准作为选药指南–针对每一菌群所选择的药物具有确切临床疗效（天然耐药不做药敏试验）–测定的药物具有可靠的体外试验方法和结果–测定药物具有代表性或指示性。–CLSI推荐药物的取舍可根据本单位抗菌药物种类确定药敏试验条件（如葡萄球菌）药敏试验条件•肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌、肠球菌属等：Mueller-Hinton（MH）琼脂•链球菌属：5%脱纤维羊血（马血、兔血）MH琼脂•淋病奈瑟球菌：GC培养基＋1％特定的生长添加剂•脑膜炎奈瑟菌：5%脱纤维绵羊血药敏试验条件•菌悬液制备–肠杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属等：生长法或直接菌落悬液法–葡萄球菌属、肠球菌属、苛氧菌：直接菌落悬液法药敏试验条件•孵育（温度、气体、时间）–温度：35℃±2℃–气体：空气，5%CO2（溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等）–时间：16-18小时，20-24小时药敏试验最低限度的质控建议纸片扩散法与MIC法质控菌株不同药敏试验结果判读•必须使用推荐的体外药敏试验方法•根据CLSI所公布的最新判断标准进行结果判断•解释标准取决于特定的给药方案和感染部位（必须与临床医师交流）肺炎链球菌对青霉素敏感性肺炎链球菌对青霉素敏感性敏感中介耐药注释青霉素注射剂（非脑膜炎）≤24≥8S:肾功能正常成人每4h静脉给药至少200万单位，每天至少1200万单位青霉素注射剂（非脑膜炎）≤0.06-≥0.12需用最大剂量静脉给药治疗（如肾功能正常成人每4h静脉给药至少300万单位口服青霉素≤0.060.12-1≥2药敏试验结果的报告•报告方式–药敏试验结果以敏感、中介和耐药表示–有些细菌对某种抗菌药物没有或罕见有耐药菌株，如β-溶血性链球菌对万古霉素，当这些细菌检测的MIC高于敏感临界值或抑菌圈直径小于敏感临界值时，则应报告为非敏感。出现这种情况应证实细菌鉴定和药敏试验结果，随后将菌株保存并递交到参考实验室。流感嗜血杆菌药敏试验结果的报告•特殊情况下的药敏试验及结果报告•特殊细菌•特殊情况下的药敏试验及结果报告•特殊部位•对分离于脑脊液中的细菌，下列抗菌药物不作为选择药物进行常规报告，因为用这些药物治疗某些细菌引起的脑脊液感染可能无效，这些药物包括：仅通过口服途径给药的Ⅰ和Ⅱ代头孢菌素(头孢呋辛钠除外)克林霉素大环内酯类四环素类氟喹诺酮类特殊情况下的药敏试验及结果报告特殊部位下列药物一般不适宜治疗尿道感染：–阿齐霉素–氯霉素–克拉霉素–克林霉素–红霉素CLSIM100-S17(M2-DD,M7-MIC)37药敏试验结果报告•罕见耐药菌株的处理和报告•如果解释标准中仅给出“S”的标准，那是由于某些细菌/抗菌药物组合，尚不存在或罕见耐药菌株。如金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌对利奈唑烷，万古霉素出现耐药–应证实细菌鉴定和药敏试验结果–保藏菌株–递交到参考实验室证实其结果药敏试验结果报告•处方注释报告严重的肠球菌感染如：心内膜炎，通常需要氨苄西林、青霉素或万古霉素（敏感株）加上一种氨基糖甙类联合治疗，除非证实对庆大和链霉素高水平耐药CLSI—theClinicalandLaboratorySdandardsInstituste•M02-A11纸片扩散法（2012）•M07-A09稀释法（2012）•M11-A07厌氧菌稀释法（2007）•M100-S23每年更新一次–药敏测定方法–与方法相对应的判断标准折点–专家系统（天然耐药、获得性耐药）–质控指南•M100每年修订，M02,M07每三年更新一次近年来CLSI重要的变化•增加天然耐药•判断折点（更新、删除）•检测方法改变•增加新的抗菌药物•删除某些药物•增加给药方案2011年增加天然耐药附表2013细菌的固有耐药附录B•肠杆菌科表格–删除了克氏枸橼酸杆菌对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/苏巴坦R–进一步阐明•非肠杆菌科细菌—新增•葡萄球菌—新增•肠球菌—新增•M100-S23page176-179固有耐药性—金黄色葡萄球菌（附录B）注1：革兰阳性菌对氨曲南，多粘菌素B/粘菌素和萘啶酮酸也有固有耐药性固有耐药性—肠球菌（附录B）*警告：对于肠球菌，头孢菌素类、氨基糖甙类（除可能出现高水平耐药筛选）、克林霉素和SXT在体内具有活性，但是在临床上使用无效时，不应报告敏感。注1：革兰阳性菌对氨曲南，多粘菌素/粘菌素和萘啶酮酸也有固有耐药性主要病原菌CLSI药敏试验变更葡萄球菌的天然耐药和获得性耐药葡萄球菌天然耐药万古霉素耐药，非常罕见获得性耐药氨曲南，奈啶酸替莫西林，多粘菌素头孢他啶青霉素耐药，约95％耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，约50％耐甲氧西林血浆凝固酶阴性葡萄球菌约80％葡萄球菌属——青霉素•90％的葡萄球菌对青霉素“R”•青霉素很少用来治疗金黄色葡萄球菌感染…但是如果青霉素已知是“S”时，它可能会被用来治疗需要较长时间疗法的感染（例如：心内膜炎，骨髓炎）•某些葡萄球菌属可能实际上具有β-内酰胺酶（BL），通过MIC或纸片扩散试验对青霉素“S”，这可能会导致病人对青霉素治疗失败。所以必须检测BL以确认青霉素的敏感性β-内酰胺酶（BL）诱导试验•血平板分离细菌•贴药敏纸片诱导BL生产（例如：苯唑青霉素或头孢西丁）•过夜培养•选择边缘区域的待检细菌•如果BL阳性，则报告青霉素R金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶(BL)•常用头孢硝噻吩BL诱导试验，但并非总是用此检测葡萄球菌BL•其他BL试验对BL更敏感：三叶试验青霉素抑菌圈边缘试验•blaZ基因PCR不是BL检测的最佳方法：blaZ编码BL的产生blaZ基因的几种类型金葡菌β-内酰胺酶阳性的（四叶交叉试验）•5％羊血琼脂•金黄色葡萄球菌ATCC25923作为β-内酰胺酶阳性指针•1U青霉素纸片•阴性菌株（青霉素敏感）金葡菌青霉素抑菌圈边缘试验（10U青霉素纸片的标准纸片扩散法）模糊：β-内酰胺酶阴性，青霉素–S清晰：β-内酰胺酶阳性，青霉素-R3个实验室中金黄色葡萄球菌BL的研究结果(N=348)金黄色葡萄球菌青霉素（MIC≤0.12微克/毫升）的报告青霉素MIC≤0.12µg/ml头孢硝噻吩β-内酰胺酶头孢硝噻吩β-内酰胺酶阳性阴性报告青霉素“R”进行青霉素抑菌圈边缘试验≥29mm的模糊区≥29mm的清晰区报告青霉素“S”报告青霉素“R”注意：如果定期做纸片扩散试验，只用检查那些29mm的边缘区域。葡萄球菌属——青霉素药敏报告•如实报告“R”的结果，•“S”不报告，但添加注释“如需要青霉素的结果请与实验室联系”。•如果青霉素结果“S”，在报告结果前需进行：头孢硝噻吩BL试验，如果结果为阴性青霉素抑菌圈边缘试验：模糊（S）苯唑西林耐药葡萄球菌—2013取消苯唑西林纸片扩散试验检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌葡萄球菌—2013•甲氧西林耐药葡萄球菌检测方法mecA或PBP2a检测苯唑西林MIC法头孢西丁MIC以及纸片扩散试验报告：苯唑西林耐药，或甲氧西林耐药预报：可预报所用头孢类抗菌药物的敏感或耐药性（除头孢洛林）葡萄球菌—2013•目前在2012年的表2C中所有的头孢菌素/青霉素将被删除。除了青霉素、苯唑西林、头孢西丁和头孢洛林以外，所有的β-内酰胺折点被删除。检测结果推测结果青霉素苯唑西林SS所有青霉素类、ß-内酰胺类/酶抑制剂符合物、头孢菌素和碳青霉烯类敏感RS耐药：不耐酶青霉素类敏感：耐酶青霉素ß-内酰胺类/酶抑制剂符合物头孢菌素碳青霉烯类RR耐药：所有青霉素类、ß-内酰胺类/酶抑制剂复合物、头孢菌素和碳青霉烯类除外头孢洛林新增ceftaroline到葡萄球菌A组药敏•广谱具有抗MRSA活性头孢菌素（五代头孢）•仅有静脉制剂•FDA批准的适应症•急性细菌性皮肤及皮肤结构感染–MRSA、MSSA、化脓性链球菌、无乳链球菌–大肠、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌•社区获得性细菌性肺炎（CABP)•肺炎链球菌、MSSA、流感嗜血杆菌•大肠、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌头孢洛林(Ceftaroline)•头孢洛林是一种具有体外抗GP和GN活性的头孢菌素。•杀菌作用是通过与青霉素结合蛋白(PBPs)结合而介导的。•能与金黄色葡萄球菌PBP2a以及肺炎链球菌与PBP2X结合，所以对MRSA、青霉素耐药的肺炎链球菌有效。•GP：金黄色葡萄球菌（MSSA和MRSA）、化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌ceftaroline•对产ESBLs、AmpC和碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌无抗菌活性•对铜绿无抗菌活性•对厌氧菌有部分抗菌活性（对脆弱类杆菌无活性）头孢洛林(MIC法、纸片扩散法)葡萄球菌—2013表1A和表2C：2013从B组删去利泰霉素；添加脚注注明来自下呼吸道的菌株不应该报道达托霉素。删除奎奴普丁/达福普丁。因为不是FDA批准的MRSA或凝固酶阴性葡萄球菌，有更好的药物治疗毒性较少的MSSA菌株。删除阿米卡星、卡那霉素、硫酸奈替米星、妥布霉素和它们的折点。只有庆大霉素仍然保留。2006≤24-8162005≤48-1632万古霉素对金葡菌的MIC(µg/ml)注意:2005年同现行的FDA标准一致纸片扩散法的标准没有改变对凝固酶阴性的葡萄球菌的标准没有改变葡萄球菌药敏试验选药（2012）2013新增头孢洛林下呼吸道感染不报告达托霉素葡萄球菌药敏试验选药（2012）链球菌耐药特征及抗菌药物选用链球菌天然耐药青霉素很少耐药氨曲南，奈啶酸替莫西林，多粘菌素低水平氨基糖苷类夫西地酸一般感染：青霉素，阿莫西林严重感染：青霉素＋庆大霉素或青霉素＋克林霉素或万古霉素青霉素过敏：根据药敏试验结果选择红霉素、克林霉素等β-链球菌—2013•β-溶血性链球菌药敏试验不必常规进行•红霉素对来自患有严重青霉素过敏孕妇的菌株的试验和报告从严重的青霉素过敏的孕妇（高风险过敏反应）分离出的β-链球菌，用红霉素和克林霉素（包括克林霉素诱导耐药）进行检测，只有克林霉素可以报告。链球菌诱导克林霉素耐药—2013•β-链球菌:如果对这些菌株进行药敏试验，应包括克林霉素诱导耐药试验。•肺炎链球菌：肺炎链球菌对克林霉素耐药机制的临床意义是未知的，但是诱导克林霉素耐药可以使用D-试验进行检测，现在将其囊括在2013年CLSI文件中。如果肺炎链球菌对克林霉素试验检测该菌株对克林霉素-S，则应进行克林霉素诱导耐药试验。红霉素诱导克林霉素耐药肺炎链球菌耐药特征及抗菌药物选用肺炎链球菌青霉素敏感青霉素耐药10％～40％首选：青霉素，氨苄青重症或脑膜炎：头孢曲松，美罗培南