GPC-周静

凝胶渗透色谱法GelPermeationChromatography(GPC)色谱法流动相气相色谱气固吸附色谱气液分配色谱液固吸附色谱液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱体积排阻色谱亲和色谱液相色谱超临界流体色谱凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱色谱法分类体积排阻色谱体积排阻色谱(SEC)：凝胶渗透色谱(GPC)，有机溶剂为流动相，高分子领域；凝胶过滤色谱(GFC)，水或水溶液为流动相，生化领域。特点：分离原理和其它液相色谱不同，溶质在两相之间不是靠其相互作用力进行分离，而是按分子尺寸的大小进行分离的。缺点:不能用于相对分子质量相同或相似的样品（例如异构体）的分离为了保证足够的分离度，两个组分之间的相对分子质量至少应当相差10%。方法端基滴定沸点升高冰点降低蒸汽压渗透光散射粘度超离心沉降凝胶色谱测定相对分子质量范围3×104以下3×104以下3×104以下3×104以下1×104~1×1071×104~1×1071×104~1×1071×102~1×107相对分子质量性质数均数均数均数均重均粘均Z均各种●测定高聚物的分子质量及其分布的最常用、最快速和有效的方法●1964年，由J.C.Moore首先研究成功●凝胶渗透色谱—用有机溶剂做流动相，具有一定孔径的多孔性填料或凝胶做分离介质的色谱柱，试样在色谱柱中按分子尺寸大小分开。高分子分子量的表征方法平均分子量的统计方法数均分子量：分子数分布函数N（M）的统计平均值iiiiiniiiiiNMmMmNM重均分子量：质量分布函数m（M）的统计平均值2iiiiiiwiiiiimMNMMmNMZ均分子量：分布函数()MmM2()MNM或的统计平均值32iiiziiiNMMNM粘均分子量：聚合物分子量与溶液粘度的关联1(1)iiiiiiNMMNMMi—多分散聚合物的分子量Ni—多分散聚合物的分子数Mi—多分散聚合物的质量分子量分布分子量分布曲线或分布函数分布宽度指数WI对多分散，宽分布的聚合物：对单分散的齐聚物：1.53.030IwnWMM1.0IwnWMM一般情况下，对于多分散体系zwnMMM聚合物的分子量均一zwnMMM◆基本原理◆数据处理◆GPC仪组成◆GPC仪应用举例凝胶渗透色谱基本原理分离原理：体积排除理论，有限扩散理论，流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排除理论等。●这些分离机理相互之间并不排斥，而是在不同的GPC条件下，哪一种分离机理占主导作用的问题。●多数情况下，体积排除理论在分离中其主要作用，随着流速的增加，有限扩散理论逐渐起作用，而流动分离理论只有在流速很高时才起作用。体积排除理论：让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋出体积小），相对分子质量小的在后面（即淋出体积大）。淋出体积（Ve）：自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。直接法是在测定淋出液浓度的同时测定其黏度或光散射，从而求出该点相对分子质量。间接法是用一组相对分子质量不等的、单分散或者多分散的试样为标准样品，分别测定它们的淋出体积和相对分子质量，确定二者之间的关系，然后绘制标定线，再用标定线计算所有实验点的相对分子质量。凝胶渗透色谱的相对分子质量检测1.单分散性标样校准曲线选用一系列与被测样品同类型的不同相对分子质量的单分散性（）1.1wnMM然后与被测样品同样条件下进行GPC分析。由于每个单分散标样的保留体积与其平均分子质量相对应，作出lgM-Ve标准曲线，然后从直线部分得到校准方程：lgM=A-BVe校正原理2.普适校正原理根据Mark-Houwink方程：η1=K1·M1α1η2=K2·M2α2式中K、α为每一种特定高分子-溶剂体系的常数。k1M1α1+1=k2M2α2+1两边取对数得：lgk1+(α1+1)lgM1=lgk2+(α2+1)lgM2由于GPC对聚合物的分离主要是基于分子流体力学体积，即对于相同的分子流体力学体积，在同一个保留时间流出。所以反过来，如果流出时间相同，则意味着两种柔性链的流体力学体积相同：[η]1M1=[η]2M2上式中k1，k2，α1，α2在固定条件下是常数，就可由第一种高聚物（标样品）的lgM-Ve标定线，应用上式直接求出第二种高聚物（被测样品）的lgM-Ve标定线。目前，通常采用单分散聚苯乙烯（PS）标样来作为第一种高聚物。对线性和无规线团形状的高分子的普适性较好，对长支链高分子或棒状刚性高分子的普适性还有待进一步研究。数据处理目前有两种方法：（1）定义法（2）函数法由于函数法得到的平均相对分子质量只适用于对称谱图，故这里主要探讨一下定义法。VeH1H2H3V1V2V3●在横坐标上对其进行等距切割●切割块的归一化高度可以代表组分的含量●切割块的淋洗体积通过标定关系可确定组分的分子量即得完整的聚合物样品的分子量分布结果iiiHWH一个聚合物样品切割成20块以上，对分子量分布描述的误差已经小于GPC方法本身的误差。数均相对分子量1n=()iiiiiWHMHMM重均相对分子量iiwiiiHMMWMH分布宽度指数iwnWMM结果计算溶剂贮缸过滤脱气泵进样品色谱柱检测器记录数据处理转换阀收集废液去循环带有循环与收集组分的GPC流程GPC仪系统流程图GPC仪组成GPC仪主要由以下四部分构成：输液系统，进样系统，色谱柱系统，检测系统输液系统包括一个溶液储存器，一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。进样系统采用六通阀进样，先由注射器将样品常压下注入样品环。然后切换阀门到进样位置，由高压泵输送的流动相将样品送入色谱柱。样品环的容积是恒定的。因此样品的重复性好。色谱柱系统GPC仪分离的核心部件。色谱柱是由不锈钢制成，具有标准尺寸:长30—100cm，内径8—10cm.常用的GPC色谱柱固定相有以下几种：凝胶类型凝胶名称耐压性流动相软质有机凝胶交联葡聚糖凝胶交联聚丙烯酰胺凝胶常压水半硬质有机凝胶高交联聚苯乙烯较高压有机溶剂硬质无机凝胶多孔硅胶多孔玻璃珠高压水或有机溶剂凝胶：含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的化学惰性的多孔性物质，具有经过交联的立柱网状的多聚体结构。它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。聚合物凝胶柱：一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。因此，“G”反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围。⑵SephadexLH-20，是─SephadexG-25的羧丙基衍生物,能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。二）聚丙烯酰胺凝胶：是以丙烯酰胺为单体，由甲叉双丙烯酰胺交联成，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P（Bio-GelP），由美国Bio-Rad厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。三）聚苯乙烯凝胶（Styragel）具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40,000,000的生物大分子，适用于有机聚合物。四）多孔性玻璃珠，多孔性硅胶适用范围广，尺寸稳定性好，耐压，易更换溶剂，流动阻力小，缺点是吸附现象比聚苯乙烯凝胶严重。凝胶固定相的特性参数渗透极限:可用来分离化合物（或组分）分子量的最大值。分离范围:指校正曲线的线性部分。孔径分布窄的凝胶其分离范围只差一个分子量的一个数量级，而孔径较宽的凝胶，其分离范围的分子量可相差三个数量级。在实际使用时可串联两根或三根不同规格的凝胶柱，扩充其分离范围。固流相比：将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为固定相，而将柱中凝胶颗粒间体积中的溶剂称为流动相，二者之比为固流相比，反映了凝胶柱的分离容量。此值越大，表明柱应用范围愈广。柱效：用每米柱高对应的理论塔板数n来表示Ve—洗脱体积wb—以洗脱体积作单位表示的基线宽度L—柱长216ebVnLw检测系统浓度检测器：示差折光检测器，紫外吸收检测器等；分子量检测方法：间接法和直接法。间接法检测器：体积指示器，通过标样制作校正曲线间接得到分子量。直接法检测器：自动粘度计检测器和小角度激光散射检测器。自动粘度计检测器原理：利用毛细管两端压力降的测定来求得相对分子质量。小角度激光散色检测器测定原理:根据散射强度变化来测定重均分子量光散射现象：一束光通过介质时，在入射光以外的各个方向也能看到观察到光强现象。本质是光波的电磁场与介质电子相互作用的结果，是一种二次发射光波。散射光和入射光的波长与频率完全相同，仅强度不同。特点:光束集中且准直性好，可免去角度和浓度的外推；测定的是流出液的重均分子量，无需标定曲线。美国WyattTechnologyCorp生产的多角度激光光散射相对分子质量测定仪（测量相对分子质量的绝对方法）系统包括：StyagelRHMW6EGPC柱（7.8×300mm）WyattOPTILABRI检测器Wyatt多角激光光散射检测仪（DOWNE）1.检测的相对分子质量范围：103-1092.检测的分子尺寸范围：10-500nm3.光源：30mWGa-As线性偏振激光4.激光波长：690nm5.激光管寿命：10，000小时不必做任何假设，不需要任何标样；既可独立使用，又可与HPLC/GPC联用；除了可得到大分子物质的绝对分子量、分子粒径和分子形状以外，还可得到分布、分支、聚集态及粘度参数等信息，并可监测反应的动力学过程。18角度激光光散射仪DAWNEOS，具有较高的灵敏度和准确度及广泛的适用性。无论是分析高温树脂，超高分子量电解质，还是生物大分子蛋白质、多糖、DNA，病毒等，它都能迅速而准确地提供可靠的相对分子质量数据。浓度检测系统检测器选择性梯度洗脱线性范围检测限(g/ml)敏感性对流速对温度紫外紫外吸收可以1052×10－10不敏感低示差通用型不可以1042×10－7不敏感10－4荧光荧光物质可以10310－11不敏感低电导离子不可以2×10410－8敏感2%※溶剂的选择：能溶解多种聚合物，不能腐蚀仪器部件，与检测器相匹配四氢呋喃，1，2，4-三氯苯（1350C），邻-二氯苯，甲苯，二氯甲烷，氯仿，二甲基甲酰胺等。最常用的四氢呋喃，但其贮存时易生成氧化物，蒸馏时易爆炸。※激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合物溶液光散射的测量。注意问题GPC应用凝胶渗透色谱法测定PAN分子量及其分布在PAN共聚物的DMF（二甲基甲酰胺）体系中，PAN共聚物的淋洗曲线出现多峰现象，而且淋洗峰大为提前。在DMF溶剂中必须加入中性盐，才能得到丙烯腈共聚物正常的GPC图。加入硝酸钠使PAN能够按照分子量大小进行凝胶渗透色谱分离,考察了准确测定PAN分子量的色谱条件，主要考察了流动相的选择，色谱柱温度及样品浓度对测定结果的影响，并与激光光散射法的结果进行了对照，误差小于2.5%并且重现性也非常好，相对标准偏差小于1.6%。凝胶色谱法测定木素分子量及其分布由于木素结构的复杂性和特殊性，在溶剂中表现了不同的流体力学性质，因此，没有一个普遍适用的测定木素分子量及其分布的色谱条件。对于不同的样品，需要用不同的凝胶柱，流动相及标样相配合。样品制备:选用THF做溶剂，木素须经过衍生化处理（乙酰化，甲基化，硅烷化）亲水性强的木素（木素磺酸盐）用水溶性凝胶色谱测定时，不需衍生化处理。实验条件的选择：室温，聚苯乙烯或硅胶高效凝胶色谱柱，流动相主要有THF,DMF,亚甲基氯或