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我国的传统名花和世界四大切花之一:菊花扦插嫁接压条菊花的组织培养指在无菌和人为控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。一、植物组织培养的概念细胞离体①必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件②原理:细胞的全能性A.外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官.③相关概念:B.脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。C.再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根或芽等器官的过程D.愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞.人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织二、植物组织培养的基本过程离体器官、组织或细胞脱分化愈伤组织再分化根、芽植物体三、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝（2）离体的植物组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配制不同的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物、植物激素MS固体培养基成分及比例讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持培养基的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影响使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂、也分化同时使用分化频率高使用比例实验结果生长素细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素细胞分裂素＝有利于根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化促进愈伤组织生长②生长素和细胞分裂素作用生长素/细胞分裂素高利于根和愈伤组织的形成适中利于根芽的分化（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右温度控制在18－22℃每日用日光灯照射12h植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物细胞培养不需要光?需要光切取形成层无菌接种诱导愈伤组织的形成试管苗的形成培养室移栽脱分化再分化举例菊花的组织培养（一）制备MS固体培养基（二）外植体消毒（三）接种（四）培养（五）移栽（六）栽培（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备1、配制各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/mL的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量2、配制培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50mL或100mL①配制培养液②调pH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分正常苗污染苗1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁污染途径1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒培养温度控制在18-22℃每日用日光灯光照12h（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间3、移栽幼苗长壮后，移栽到土壤中固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培珍珠岩,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩。蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。（六）栽培幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花三、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季作业：P361、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。2、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。本课题内容小结菊花组织培养基础知识实验操作植物体的组织培养影响组织培养的因素细胞分化细胞全能性组织培养过程营养激素环境条件MS固体培养基制备外植体消毒接种培养移栽栽培