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免疫酶技术及其应用——ELISA.1酶联免疫法ELISA50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种免疫测定技术。.2免疫标记技术免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定.3免疫酶技术免疫酶技术(enzymeimmunoassay)：是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶（AP）。.4基本原理①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。.5酶联免疫法ELISA.6.7实验材料ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的材料：1.固相的抗原或抗体2.酶标记的抗原或抗体3.酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。4.相应的检测仪器..8检测方法1。夹心法双抗体夹心法测抗原（常用）双抗原夹心法测抗体2。间接法测抗体（常用）3。竞争法竞争法测抗原竞争法测抗体4。捕获包被法测抗体5。亲和素-生物素ELISA法.9双抗体夹心测抗原.10双抗体夹心测抗原待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单价抗原的测定。.11双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。.12间接法测定抗体.13间接法的特点本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。.14竞争法测抗原.15竞争法测抗原（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。.16竞争法测抗原◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与固相抗体的结合最充分。.17竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。.18捕获包被法测抗体样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。.19操作步骤如下（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗IgM，洗涤。（2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤。（3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM结合，洗涤。（4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在特异性IgM抗体，是为阳性反应。.20亲和素-生物素-ELISA法亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。.213.与固相抗原的竞争结合取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100μl，加入酶标板的抗原孔中，放入37℃恒温培养箱中60min。洗板3次。100ul稀释板酶标板37℃，60min洗板3次适用于优点注意双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法，适用于检验各种蛋白质等大分子抗原特异性高不能检测小分子抗原及半抗原双抗原夹心法测抗体乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。间接法测抗体是检测抗体最常用的方法,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体1.关键抗原的纯度2.另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体竞争法测抗原小分子抗原如激素和药物等ELISA测定多用此法。快，只有一次保温洗涤过程需要较多的酶标记抗原.22实验材料：羊抗人血清白蛋白抗体（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线）待检人血清白蛋白辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2终止液：2mol/LH2S04酶标反应板（一条/人）方法适用于竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检验特异性抗体捕获包被法测抗体主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定ABS-ELISA法ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。.23.24实验前准备：制备纯化抗原或抗体制备抗原或抗体包备液包被微孔板制备酶标记抗体或抗原制备酶催化底物终止液.25实验步骤：1.加样：加待检样品0.05ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育30分钟。(设置空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔各加0.05ml对照标准)。2.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔,停滞15秒弃去.重复5次.3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育30分钟.4.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔,停滞15秒弃去.重复5次.5.加底物液显色：于各反应孔中加入底物A液和底物B液各0.05ml，置37℃孵育15分钟。6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。.26实验操作：.27固定OD值.28.29三、操作步骤1.包被抗原抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。抗原100ul/孔湿盒中，4℃过夜酶标板.302.抗原与抗体的预孵育制作标准曲线：在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定浓度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30min。待测抗原：取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。待测抗原50ulPBS50ul50ul稀释液50ul50ul100ul标准抗原250ul抗体稀释板37℃，30min.31