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定义印迹法（blotting）：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探针反应来检测样品的一种方法。SouthernBlot：1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法。DNA印迹SouthernBlotRNA印迹NorthernBlot单向电泳后的蛋白印迹WesternBlot双向电泳后的蛋白印迹EasternBlot实验目的检测一个基因的表达产物是否正确--定性比较表达产物量的相对变化--半定量与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。基本原理基本流程转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基本流程（电泳凝胶）蛋白样品的制备制备流程天然蛋白：细胞总蛋白、组织总蛋白、膜蛋白、核蛋白用细菌或酵母人工表达的蛋白破碎细胞液氮研磨匀浆超声波处理反复冻融提取蛋白细胞裂解液冰上裂解30min高速离心4℃12000rpm离心10min取上清蛋白定量BCA法Bradford法Lowry法细胞破碎1、液氮研磨法2、机械匀浆法3、超声波处理法4、反复冻融法：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5、化学裂解法：去氧胆酸钠、SDS6、酶解法：细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理；植物细胞壁可用纤维素酶处理。蛋白提取水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。细胞裂解液（RIPA）：50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%去氧胆酸钠，1mmol/LPMSF，2μg/mLAprotinin，2μg/mLLeupeptin（使用前加），pH7.5有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。冰上操作蛋白定量蛋白上样量需达到一定的范围保证开始实验的总蛋白量是一致的蛋白定量原理1.BCA（bicinchoninicacid）法在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，此物在562nm波长处有最大吸收，颜色深浅与蛋白含量成正比。2.Bradford法考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处。3.Lowry法蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生蓝色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。蛋白定量原理4.双缩脲法当需要快速，但不很准确的测定中，常使用双缩脲法。原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。5.紫外吸收法蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。基本流程转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）SDS-PAGE凝胶配制（2）样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。（3）上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到胶加样孔内即可。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳(50-60V)，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳（100-120V）。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：浓缩效应：样品中蛋白质被浓缩在浓缩胶和分离胶的界面。电荷效应：等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同。分子筛效应：分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同。样品的印迹转膜膜的选择硝酸纤维素膜PVDF膜尼龙膜价格便宜易封闭，背景低极强的蛋白结合能力易破脆，不易操作信噪比高多用于核酸的转移，封闭较困难，背景高根据蛋白分子量选择不同孔径的膜：20kDa：0.45μm膜20kDa：0.2μm膜转膜方法毛细管印迹法滤纸、凝胶、膜、滤纸重物压住毛细作用使缓冲液流过凝胶，将蛋白质带到膜上效率低（10％～20％）电泳印迹法用有孔的塑料或有机玻璃板将凝胶和膜夹成“三明治”形状湿转法、半干法转膜湿转法：将膜、胶叠层浸入缓冲液槽中然后加电压；胶在负极，膜在正极；慢，需要大体积冰预冷缓冲液；适用于分子量较大的蛋白；半干法：用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽；胶在负极，膜在正极；快（15～45min）；适用与小分子量蛋白；转膜步骤（湿转法）1、电泳完毕后，将膜和滤纸裁至与胶相同大小，并在胶上裁去一角做标记；2、将胶、膜、滤纸浸泡在转移缓冲液中平衡15min-30min（PVDF需先在100%甲醇中浸泡数秒钟）；3、打开夹板使黑的一面保持水平，按海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵垫的顺序叠放；4、赶走气泡后合起夹子。（膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路）将夹子放入转移槽中，夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。5、冰上100V350mA转膜1h，或30V90mA转膜过夜。小型Trans-Blot转印槽半干转印仪影响转膜效率的因素转移缓冲液的平衡时间影响转膜效率的因素SDSSDS有助于蛋白迁移到膜上，但过量的SDS会抑制蛋白与膜的结合，转印缓冲液中加入0.1％会促进转印建议的步骤在转印缓冲液中不含有SDS，但凝胶在电泳后不需要浸泡在转印缓冲液中；凝胶中残留的SDS对于有效的转印已经足够。甲醇甲醇通过在蛋白上剥离SDS促进蛋白和膜的疏水接合。活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合；可降低蛋白质洗脱效率，增加蛋白质和NC膜的结合能力。影响转膜效率的因素凝胶浓度：丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移。电压或电流膜的选择免疫学检测封闭封闭未吸附蛋白的疏水结合位点，以减少非特异性结合背景的影响。室温封闭1h-2h。5%-7%脱脂奶粉（不适用于生物素－亲和素检测和碱性磷酸酶底物检测系统）1%-3%BSA血清公司提供的WB封闭液一抗二抗孵育一抗：一般是用待测蛋白免疫动物A（如兔、鼠），获得的多克隆或单克隆抗体，如小鼠抗人NGF二抗：另一种动物（如羊）的抗动物A的免疫球蛋白抗体（放射性标记或酶标记），如羊抗小鼠IgG/HRP抗原一抗二抗人NGF小鼠兔一抗二抗孵育把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与膜温育。室温孵育1-2h，或4℃过夜。倒掉一抗（用封闭液稀释），用1×TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗（用封闭液稀释），室温孵育60-80min。倒掉二抗溶液，用1×TBST洗膜3次，每次10min。显色酶联法：HRP（辣根过氧化物酶）：底物为DAB，产生红褐色。AP（碱性磷酸酶）：底物为NBT/BCIP，产生蓝紫色。底物化学发光ECL：二抗中的HRP或AP与发光底物作用使其发光，然后经底片曝光显影记录下来。生物素标记地高辛标记荧光标记显色步骤化学发光（ECL），显影和定影将A和B两种试剂等体积混合，把膜移至一保鲜膜上，将混合液滴于膜上，室温孵育2min后把膜放到另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X－光片夹中。暗室中，红灯下取出X-光片，切纸刀剪裁适当大小。打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，关上。根据信号的强弱适当调整曝光时间。曝光完成后，取出X-光片迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后终止显影。把X-光片放入定影液中定影至胶片透明为止。