发酵工程综合性实验-2青霉素发酵实验

1发酵工程综合性实验2：青霉素的发酵一、目的与要求1、学习青霉素生产发酵的工艺流程；2、学习微型发酵罐（5L）的使用；2、通过实验，以具体的青霉素发酵生产工艺流程为例，学习发酵原理，掌握种子制备、发酵过程控制、与发酵相关参数的检测，掌握效价测定方法；二、实验原理1、工艺控制（1）影响发酵产率的因素基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制,苯乙酸的生长抑制）,而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成,为了避免这一现象,在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法,即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加,因为即使是超出最适浓度范围较小的波动,都将引起严重的阻遏或限制,使生物合成速度减慢或停止。目前,糖浓度的检测尚难在线进行,故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制,而是间接根据pH值、溶氧或C02释放率予以调节。（2）温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别,但一般认为应在25°C左右。温度过高将明显降低发酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗,降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说,最适温度不是一样的,一般前者略高于后者,故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间,到达生产阶段后便适当降低温度,以利于青霉素的合成。（3）pH值青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右,有时也可以略高或略低一些,但应尽量避免pH值超过7.0,因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中,pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。（4）溶氧对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点,而氧消耗与碳能源消耗成正比,故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。（5）菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度,从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度(取决于维持因数的大小,维持因数越大,呼吸强度越高)、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消2耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升,从而提高临界菌体浓度。（6）菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比,当比生长速率高于O.015h-1时,比生产速率与比生长速率无关D因此,要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长速率不低0.015h-1。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说,维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每46h就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍,这在实际工业生产中是很难实现的。事实上,青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多,却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶,抵消了一部分生长,故虽然表观比生长速率低,但真比生长速率却要高一些。（7）菌丝形态在长期的菌株改良中,青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触,故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低,使气-液两相间氧的传递速率大大提高,从而允许更多的菌丝生长(即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。在丝状菌发酵中,控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度,并避免结球,是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量,也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。3、工艺控制要点（1）种子质量的控制丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25°C培养7天,真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内,26°C培养56h左右,菌丝浓度达6%-8%,菌丝形态正常,按10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27°C培养24h,菌丝体积10%-12%,形态正常,效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O.5%-1.0%玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子,然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子(又称生产米),亲米和生产米均为25°C静置培养,需经常观察生长发育情况在培养到3-4天,大米表面长出明显小集落时要振摇均匀,使菌丝在大米表面能均匀生长,待10天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养,生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在5°C冰箱内。工艺要求将新鲜的生产米(指收获后的孢瓶在10天以内使用)接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28°C培养50-60h当pH值由6.0-6.5下降至5.5-5.0,菌丝呈菊花团状,平均直径在100-130μm,每毫升的球数为6万-8万只,沉降率在85%以上,即可根据发酵罐球数控制在8000-11000只/ml范围的要求,计算移种体积,然后接入发酵罐,多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳,其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。（2）培养基成分的控制3a.碳源产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液(DE值50%以上)进行流加。b.氮源氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c.前体生物合成含有苄基基团的青霉素G,需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺,一次加入量不大于0.1%,并采用多次加入,以防止前体对青霉素的毒害。d.无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等,且用量要适度。另外,由于铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子的浓度,一般控制在30μg/ml。（3）发酵培养的控制a.加糖控制加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的pH值确定,最好是根据排气中CO2量及O2量来控制,一般在残糖降至0.6%左右,pH值上升时开始加糖。b.补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素,使发酵液氨氮控制在O.01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08%。-c.pH值控制对pH值的要求视不同菌种而异,一般为pH6.4-6.8,可以补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。d.温度控制前期25-26°C,后期23°C,以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e.溶解氧的控制一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30%。通风比一般为1:0.8L/(L•min),搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f.泡沫的控制在发酵过程中产生大量泡沫,可以用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂泡敌来消泡,应当控制其用量并要少量多次加入,尤其在发酵前期不宜多用,否则会影响菌体的呼吸代谢g.发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样,用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称镜检,根据镜检中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度,通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间,以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸,并出现个别自溶细胞,这表示菌丝趋向衰老,青霉素分泌逐渐停止,菌丝形态上即将进入自溶期,在此时期由于茵丝自溶,游离氨释放,pH值上升,导致青霉素产量下降,使色素、溶解和胶状杂质增多,并使发酵液变蒙古稠,增加下一步提纯时过滤的困难。因此,生产上根据镜检判断,在自溶期即将来临之际,迅速停止发酵,立刻放罐,将发酵液迅速送往提炼工段。三、材料和用品实验用菌种：Penicilliumchrysogenum产黄青霉，用于发酵；Staphylococcusaureus、Bacillussubtilis金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌，效价检测用。实验药品：玉米浆、蔗糖、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、无水硫酸钠、硫酸锰、牛肉膏、蛋白胨、NaCL、实验器皿：灭菌锅、培养箱、超净工作台、小型发酵系统（用大三角瓶）、烘箱、水浴锅、5L发酵罐4四、实验内容1、实验流程①实验器材的准备和菌种的活化→②种子培养（种子培养基，25°C，摇床培养48~52h）→③上罐发酵（发酵培养基，25°C摇床培养4d）→④每16小时取一次样液，20毫升左右，测PH，青霉素效价，残糖。2.实验步骤（一）种子制备①种子培养基配制培养基的组成（％）：玉米浆3.8，蔗糖2，硫酸铵0.2，碳酸钙0.1，硫酸亚铁0.02，pH4.7～4.9。②培养基的分装及其灭菌将配好的培养基分装到250mL摇瓶中，每瓶60mL，最后将培养基置于121℃灭菌20min。③接种将已经活化的斜面种子接种到摇瓶中25℃摇床中培养。④培养时间及镜检一般种子培养需要2-3d左右，然后利用镜检来检测培养过程是否染菌。（二）发酵过程及控制①发酵培养基配制培养基的组成（％）：玉米浆4，蔗糖1，磷酸二氢钾0.5，无水硫酸钠0.5，碳酸钙0.07，硫酸亚铁0.018，硫酸锰0.0025，泡敌0.03，pH4.7～4.9。2．培养基装罐及其灭菌将配好的培养基装到发酵罐中，121℃实罐灭菌20min。3．接种：将已经培养好的种子接种到发酵罐中，25℃发酵。4．观察和取样：观察发酵过程中是否存在异常情况，如发酵液颜色、气味、溶氧等是否异常等情况。每16-24h取样一次，每次20mL左右。5．发酵时间及镜检：发酵需要4d左右，然后利用镜检来检测发酵过程是否染菌。（三）发酵过程中生理生化指标的检测1.利用称重法测定生长曲线：将每批次的样品（5-10mL）离心后称重，测得不同时间菌体的质量，以时间为横坐标，质量为纵坐标，得到曲线。2.测还原糖：利用DNS法，测定每批次的样品（5-10mL）离心后的发酵液的还原糖的含量，以时间为横坐标，含量为纵坐标，得到曲线。（具体测定方法请参照附录1）（四）青霉素效价测定（利用抑菌圈的实验方法测定青霉素效价）1.培养基配制LB液体培养基2.指示菌的培养选取指示菌金黄色葡萄球菌、枯草杆菌接种到灭过菌的液体培养基中，在37℃左右培养24-36h。3.抑菌试验步骤a.取0.2mL培养好的指示菌于平皿中，每种菌做2-3个平行样。b.用涂棒将指示菌在平皿中涂布均匀。c.用打孔器在涂布均匀的平皿中央打孔。5d.取0.1mL不同时间取样的发酵液于孔中。e.最后将平皿放置于370C左右培养箱中培养并观察。四、实验结果分析1.绘制pH-t（时间）曲线；2.绘制生长曲线（即干重-t曲线）。；3.绘制残糖变化曲线；4.绘制青霉素效价（透明圈直径表示）变化曲线