第十章--蛋白质和氨基酸的测定

第十章蛋白质和氨基酸的测定本章要点凯氏定氮法原理、分步、测定方法。双缩脲法测定原理。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。TLC法原理、方法。第一节概述（1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数（4）蛋白质测定方法（1）蛋白质的生理功能及在食品中的作用①蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。②人体的酸碱平衡、水平衡的维持；③遗传信息的传递；④物质的代谢及运转都与蛋白质有关。⑤人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质⑥食品的重要营养指标。(2)食品中的蛋白质含量及测定意义在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。（3）蛋白质的性质蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万~数百万。从组成上看：化学元素C、H、O、N（P、S、Cu、Fe）；它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，官能基团：肽键、氨基酸残基、酸碱基团、芳香基团结论：含氮是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，蛋白质的量与氮含量的关系用蛋白质系数表示：蛋白质系数——每份氮素相当于的蛋白质的份数。一般蛋白质含氮为16%，所以1份氮素相当于6.25份蛋白质。此数值（6.25）称为蛋白质系数，用F表示。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。（4）蛋白质系数（5）蛋白质测定方法测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算，如密度、折射率、紫外吸收、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算，如定氮、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂反应等主要测定方法有：双缩脲法染料结合法酚试剂法紫外分光光度法水杨酸比色法折光法旋光法近红外光谱法目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法第二节蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了5种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）第三节蛋白质的定量测定一、凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法：常量法、微量法及改良凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法（1）原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。①样品消化：2NH2-(CH2)2-COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O浓硫酸的作用：脱水作用——使有机物脱水并被炭化为C、H、N氧化作用——将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4＋C＝2SO2↑＋2H2O＋CO2↑二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加快有机物的分解（3380C4000C）K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3↑但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4(NH4)HSO4=NH3↑+SO3↑+H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。加入硫酸铜的作用催化作用：加速有机物的氧化分解2CuSO4→Cu2SO4＋SO2↑＋O2↑C＋2CuSO4→Cu2SO4＋SO2↑＋CO2↑Cu2SO4＋2H2SO4→2CuSO4＋2H2O＋SO2↑此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。消化完全指示：蓝绿色；②蒸馏在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3↑+Na2SO4+2H2O蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀③吸收用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8X10-10），与氨形成强碱弱酸盐，酒红色→蓝绿色2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O④滴定待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定,蓝绿色→灰红色(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3讨论：1、实验中用到哪些试剂？作用是什么？适用范围：此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定仪器、试剂:500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置消化用：①浓硫酸②硫酸钾③硫酸铜蒸馏用：④40%氢氧化钠溶液吸收用：⑤4%硼酸滴定用：⑥HCl标准溶液⑦0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂微量凯氏定氮法操作步骤样品消化→蒸馏→吸收→滴定①样品消化:准确称取一定量的样品至干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→轻轻摇匀，以45º斜支于石棉网上→用电炉以小火加热(或将烧瓶放在距电炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉，取下烧瓶、冷却→转移至100mL容量瓶中，加水定容。注意问题：①加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈；②消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全；③样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫；④消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。思考：1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？2、如何判断消化的终点？②蒸馏与吸收：按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10mL40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min蒸馏、吸收注意问题：（1）整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。（3）加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。（4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏；吸收液温度不应超过40℃，若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（5）在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打开夹子，即可放出废水。（6）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。③滴定将接受瓶内的硼酸液用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。(4)结果计算式中W—蛋白质的质量分数，%；c—盐酸标准溶液的浓度，mol/L；V1—空白滴定消耗标准液量，mL；V2—试剂滴定消耗标准液量，mL；m—样品质量，g；0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；F—蛋白质系数。10010010014.0)(12mFVVcW二、双缩脲法双缩脲的性质：当脲被小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3测定原理：蛋白质分子中肽键（—CO—NH—）与双缩脲结构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。特点：简单快速，灵敏度低，常用于生物化学领域。染料结合法：原理：在特定的条件下，蛋白质可与某些染料定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食品。水杨酸比色法原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸和次氯酸钠作用生成兰色化合物，在660nm处比色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。第五节氨基酸的定性测定利用各种显色反应（170～174页）。第六节氨基酸定量测定双指示剂甲醛滴定法电位滴定法茚三酮显色法氨基酸的分离及测定蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。氨基酸的含量一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是目前许多保健食品的质量指标之一，其中的含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮，故称为氨基酸态氮。氨基酸态氮反映的是样品中游离氨基酸的总量。氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法电位滴定法双指示剂甲醛滴定法原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，用间接的方法测定氨基酸的总量。方法特点及应用此法简单易行、快速方便。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高；酪氨酸含有羟基，滴定时会消耗碱液使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果高。特别适合浅色样品的测定试剂①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液③0.1%中性红50%乙醇溶液④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液操作方法①预处理：移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份②中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸的含量）：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点，记录V1③滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离酸的总含量）