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基因表达载体的构建基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1、基因表达载体的构建目的基因表达载体的构建——基因工程的核心使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给后代使目的基因能够表达和发挥作用2、基因表达载体的组成：目的基因标记基因启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶的结合位点，驱动基因转录出mRNA。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来①用_________切割质粒，使其出现切口，露出____________。②用____________切断目的基因，使其产生_______________。3、基因表达载体的构建过程③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割目的基因和载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意限制酶的选择：一种限制酶切割结果分析思考讨论：使用EcoRⅠ一种限制酶切割外源DNA和质粒，构建基因表达载体时，可以形成哪些连接产物？下图箭头表示EcoRⅠ的酶切位点，EcoRⅠ识别序列及切点为G↓AATTC。质粒自身环化；含目的基因的源DNA自身环化；质粒和含目的基因的外源外DNA反向连接；质粒和含目的基因的外源DNA正向连接难点突破质粒抗生素抗性基因质粒EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目的基因外源DNA限制酶的选择：EcoRⅠ切割结果分析GAATTCCTTAAG……GAATTCCTTAAG……目的基因AATTCGGCTTAA11'21和1'连接2和2'连接自身环化相互连接1和2连接，1'和2'连接1和2'连接，1'和2连接正向反向限制酶的选择：两种限制酶切割结果分析思考讨论：选用EcoRⅠ和HindⅢ两种限制酶切割外源DNA和质粒，可以形成哪些连接产物？下图箭头表示两种限制酶的酶切位点，EcoRⅠ和HindⅢ识别序列及切点分别为G↓AATTC，A↓AGCTT。EcoRⅠHindⅢEcoRⅠHindⅢ目的基因外源DNA质粒和含目的基因的外源DNA正向连接质粒抗生素抗性基因质粒难点突破限制酶的选择：EcoRⅠ和HindⅢ切割结果分析GAATTCCTTAAG……AAGCTTTTCGAA……目的基因AATTCGATTCGA11'2正向连接：1和2连接，1'和2'连接EcoRⅠHindⅢEcoRⅠHindⅢ例1、【2012年江苏第32题】图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基进行培养。BamHⅠ抗生素B例2、【2016年江苏高考33题】下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用两种限制酶切割。BclⅠ和HindⅢ（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加。四环素例3、【2019年江苏33题】下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。为了筛选出转入了重组质粒的菌落，应在筛选平板培养基中添加。氨苄青霉素123456789添加氨苄青霉素的培养基添加四环素的培养基平板影印培养法√√√基因表达载体的构建概念图基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因复制原点目的RNA聚合酶识别和结合部位终止转录鉴别和筛选导入目的基因的受体细胞DNA复制起点基因工程的核心意义作用作用作用作用