动物基因工程

第八章哺乳动物基因工程Greenfluorescentmouse高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型研究哺乳动物基因功能的基础：第一，必须能通过克隆分离出基因。；第二，必须能在试管里操作基因序列；第三，必须能够将改变过的基因重新送入细胞里以确定它是如何发挥功能的。其中第三方面以多种形式形成阻止人们前进的障碍。第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记常用的选择基因有：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Eco-gpt)、细菌的新霉素磷酸转移酶基因(Eco-neo)等。嘌呤嘧啶的生物合成二氢叶酸还原酶腺嘌呤磷酸核糖基转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶二氢叶酸还原酶胸苷激酶互补选择的分子基础：适当的使用这些抑制物，我们可以选择性的控制某一个合成途径。这就是说，当细胞的一种代谢途径发生缺陷时，可以从另一种代谢途径得到补偿，从而能继续存活，因此容易得到突变体；但是，另一种代谢途径也被一种特殊的药物所阻断时除非导入野生型基因取代突变的基因，否则细胞就会死亡。另一方面，有一些对抑制补救合成途径的药物呈抗性的基因，在没有补救前体合成的情况下，也可以用作显性选择标记。选择原理：tk(thymidinekinase)基因及hprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-或hprt-，将细胞培养在含HAT（H：hypoxanthine黄嘌呤，A：aminopterin氨甲喋呤，T：thiymidine胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三中核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或hprt基因的存在细胞才可生长。5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黄嘌呤核苷（HR）GMPAMP嘌呤核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）氨甲喋呤（AP）氨甲喋呤（AP）从头合成途径补救合成途径尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘧啶核苷酸生物合成途径（TK）胸腺嘧啶核苷激酶dhfr（dihydrofolatereductase，二氢叶酸还原酶）基因的筛选：受体细胞必须是dhfr-，将细胞培养在含HT的培养基中。真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。7,8二氢叶酸+NADPH+H+5,6,7,8四氢叶酸+NADP+DHFR氨甲喋呤抑制哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A第二节哺乳动物的载体系统一、SV40病毒载体二、反转录病毒载体三、其他的病毒载体目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物病毒经改造而成。用得比较多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、单纯疱疹病毒（HSV）、Rous肉瘤病毒、EB病毒等。在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以下几个表达元件：启动子与增强子终止信号与加尾信号剪接识别信号复制与选择元件1、SV40的生物学特性SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA.SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。SV40DNAoriVP2TVP3VP1t一、SV40病毒载体t/T基因编码病毒的小抗原和大抗原与病毒的致癌作用密切相关。SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白。早期表达：两个6聚体的T抗原结合在SV40DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。2、SV40基因组的改造晚期表达:在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白。SV40有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。去掉T抗原基因的病毒，保留晚期复制启动子。不能复制，但能包装。提供外壳蛋白。去掉VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达启动子。不能包装，但能复制。3、SV40（猿猴空泡病毒）病毒载体：两种类型：1.取代型的重组病毒载体：外源基因直接插入在缺陷的病毒基因组上，由于插入的外源片断，在大小上被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增值，并被包装成病毒颗粒。但为补充这段被取代的病毒基因组DNA的功能必须使用一种与之互补的辅助病毒。感染细胞，整合提供VP外壳蛋白提供T抗原包装成的病毒颗粒中，既有含外源基因的重组型，又有助手型DNA。COS细胞用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin,SV40）。有SV40的T抗原，有利于SV40来源的载体复制。病毒不能复制，但能产生T抗原（类似重组型SV40）。DNA整合到猴染色体上。所以COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40DNA。病毒基因组部分只留下维持哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增值。这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的DNA分子载体。2.重组的病毒-质粒载体重组的SV40DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。保留SV40的复制起始区（ori）、早期区域（T抗原）的启动子、PolyA化位置以及t抗原的内含子。如pSV2:b区：324-3369bp，pBR322的复制起始区、氨苄青霉素抗性基因。c区：3370-4217bp，t抗原内含子（拼接信号）、PolyA化位置。d区：外源基因插入位置。a区:1-323bp，SV40的复制起始区、T抗原启动子、转录起始区。不需要包装，可插入10kb以上的外源基因。既能在大肠杆菌中增殖，又能转染哺乳动物细胞。受感染的动物细胞不会裂解，能建立稳定的细胞株。pSV2的特点不能在猴细胞中复制（没有T抗原）。在哺乳动物中存在的途径是整合到染色体上。pV2-GPT是一种SV40DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔β-珠蛋白。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV404218bp利用SV40DNA载体表达外源基因的程序SV40载体病毒晚期基因启动子筛选标记ori缺陷的SV40辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染pcDNA3.1CATCAT：ChloramphenicolAcetylTransferase（氯霉素乙酰转移酶;用于分析表达量）二、反转录病毒载体反转录病毒是单链RNA病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。1、反转录病毒(retroviruses)反转录病毒是一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。除此之外，在其病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分。反转录病毒的生命周期迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒，例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV)等等，但其中研究得最为详尽的则是劳斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus，RSV)。RSV病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。反转录病毒具有许多优点，便于发展作为动物基因克隆载体：第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。第三，反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。2、反转录病毒载体病毒复制所需要的RNA(DNA)序列可以严格地区分为顺式元件和反式元件两类，且这两类可以分开。这一特点便于将它改造成不能自我复制的重组病毒，用作基因转移载体。基因组的中心部分是病毒基因组的反式元件由gal、pol和env三个病毒基因的编码序列组成。反式元件的两翼是它的顺式元件研制反转录病毒载体的基本原则：去掉反式序列而保留所有的顺式序列，这样的载体具有反转录病毒基因组的全部功能，但不能包装蛋白质，其自身不能成为侵染细胞的病毒粒子。同时，把病毒RNA的包装信号ψ去掉，转入适当细胞系后制成受体细胞。受体细胞（如PA317细胞）具备野生病毒的全部功能，但不能将病毒RNA包装到膜蛋白中。反转录病毒质粒载体利用DNA体外重组技术，将克隆在大肠杆菌pBR322质粒载体的原病毒DNA，移去gag、pol和env等3个基因的大部或全部序列，保留下5’-LTR、3’-LTR序列以及PBS-ve、PBS+ve和包装位点psi。然后将一种作为选择标记的外源基因，例如neo、gpt、dhfr或hprt等插入其中，构成重组的反转录病毒质粒载体。在选择标记基因插入时，要使它的起始密码子ATG恰好是安放在病毒gag基因的原来位置上。这样，插入的选择标记基因才会在5’-LTR指导下转录，并且也才会从正确的ATG密码子启动转译。反转录病毒的基因组能够承载数个外源基因，最大的插入片段可达6kb左右，这样重组的反转录病毒仍能正常地增殖。而如果在包装之前能通过剪辑作用使基因组长度缩短，那么插入的外源DNA则可增加到20kb。由此可见，反转录病毒基因组具有相当大的克隆能力。现在已经发展出许多种反转录病毒的表达载体。反转录病毒表达载体•-插入在反转录病毒表达载体上非选择的外源基因，是利用自己的启动子进行表达的，因此文献中有时也称这种载体为内部启动子载体(internalpromotervector)。另外一种表达载体，则是利用反转录病毒LTR启动子表达外源基因的，由于在这种载体中同时插入两个外源克隆基因，所以有时也称之为双基因表达载体(dualexpressionvector)，简称DE载体。1、痘苗病毒载体痘苗病毒(Vacciniavirus)具有双链DNA基因组，同天花的病原体大花病毒（Variolavirus)的亲缘关系十分密切。当人们接种了痘苗病毒之后，便可获得对天花的高度免疫性。在DNA重组技术发展之后不久，就有人将外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因组中，得到了具有生物活性的重组病毒。根据这一发现，基因工程学家便设想构建能够表达多种病原体抗原的重组痘苗病毒，作为预防这些病原体感染的活疫苗。三、其他的病毒载体2、乳头瘤病毒载体乳头瘤病毒(Papillomaviruses)能够感染包括人类在内的多种脊椎动