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膜片钳技术讲座2002年11月20日第一部分膜片钳技术基本概念第二部分离子通道基本知识第一部分膜片钳技术的基本概念主要内容1.膜片钳技术简介2.膜片钳系统中的电位（电压）与电流3.膜片钳系统中的电阻4.膜片钳系统中的电容5.膜片钳系统中的串联电阻和电容补偿6.膜片钳系统中的漏减功能7.膜片钳系统中的信号滤波1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patchclamptechniques）。1980年Sigworth等获得10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，1983年10月，《Single-ChannelRecording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。1.膜片钳技术简介内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。膜片钳记录技术创立以来，记录方式的变化经典记录模式：贴附式（Cell-attached或oncell)内膜向外式(Inside-out)外膜向外式(Outside-out)全细胞记录方式(Whole-cellrecording)发展记录模式：穿孔膜记录方式（Perforatedpatches）穿孔囊泡记录方式（Perforatedvesicles）高阻封接巨膜片记录方式（Gigaseal-Macropatch）松散封接记录方式(Loosepatchclamp)细胞内灌流记录方式(Intracellularperfusionpatch)巨大切割膜片钳记录方式（Giantexcisedpatches）使用的标本从肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元发展到卵母细胞、内分泌细胞、血细胞、肝细胞等其它多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到脑片或组织块乃至整体动物。从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到大鼠、人等等。卵母细胞膜片钳技术、脑片膜片钳技术脑片膜片钳技术1．脑片撕裂法（Slicerendingmethod）（引自：Stuartetal.,1993）（引自：AscherP,1989）10μM10μMab（引自：TheAxonGuide》，1993。有改动）2．表面清洁法（Surfacecleaning法）3.红外微分干涉相差显微镜法（IR-DIC法）4.盲法（Blind法）2.膜片钳系统中的电位（电压）与电流钳制电位（Holdingpotential,Vh）人为地将细胞膜内外电压差固定在某一数值，这一数值即为钳制电压或钳位电压。实施这一行为的技术为电压钳技术（Voltageclamp）。命令电压（Commandvoltage,Vcmp）通过放大器或计算机发出的电压指令，用于钳制细胞膜电位。电极电压降（Pipettevoltagedrop，Vp）由于有电极电阻（Rp）的存在，命令电压通过时就会产生电压降：Vp=IRp，因此细胞接受的钳位电压为Vh=Vcmp-Vp。误差产生。而信号电压在被摄取时也会经过电极电阻，同样会产生电压降，产生误差。补偿方法：串联电阻的补偿。液界（接）电位（Liquidjunctionpotential）主要成分：1.液体--金属：Pt电极、AgCl电极与电极内液，又称电极电位；2.电极内液--细胞外液；3.电极内液--细胞内液（细胞较小、电极开口较大时，此值较小，破膜后，等待一定时间即可消除）。范围：可达几百mV。补偿方法：“Track”，“Offset”。浴液电位（Bathpotential,Vb）一般情况下，浴液通过参比电极接入工作地，所有测量的电信号均为相对于此工作地的电位或电流。为真实地反映测量信号V，理论上要求Vb为0。V=Vtotal-Vb，Vb=IRb，V为测量信号，I为钳制电流。Vb的存在主要是因为浴液电阻Rb的存在。减小Rb就可降低Vb。要减小Rb就必须知道Rb的来源。Rb大体上有三个来源：1.细胞膜表面与参比电极之间的浴液通路电阻Ra=ρ/4πr(mm)，r为细胞半径。一般为几百Ω。2.琼脂盐桥电阻Ragar=ρL(cm)/S(cm2)，浴液与KCl液。长1cm，直径2mm的盐桥，Ragar=130Ω(KCl液),Ragar=2600Ω(Ringer液)3.参比电极电阻与接触面积有关（越大越好），一般上kΩ。总电阻大于1kΩ。在下列情况下，浴液电阻Rb会发生变化，导致记录的信号出现偏差：1.浴液中Cl-浓度发生大的变化；（AgCl直流漂移）2.浴液温度浓度发生大的变化；（ρ）3.钳制大细胞如卵母细胞时（钳制电流较大）。减小Rb的方法：1.去除琼脂/KCl盐桥盐桥的优点：解决AgCl直流漂移，防止Ag、Pt进入浴液；盐桥的缺点：盐桥电阻，KCl扩散2.增大参比电极与浴液的接触面积其它控制Vb的方法：钳制、去除电极（Electrode）最常用的是Ag/AgCl电极和Pt电极。1.Ag/AgCl电极Ag+Cl-AgCl+e-（记录电极接受电子）特点：①可逆性；②消耗性；③适用于浴液中含有Cl-的情况；④使用不当时，Ag+可进入浴液影响蛋白活性。2.Pt电极2H2O+2e-→2OH-+H2↑2H2O-2e-→4H++O2↑特点：①不可逆性（不同电流方向化学反应不同）；②不消耗性；③液体与Pt之间的液界电位较大；④可导致局部pH发生变化。3.Electrode与pipette的区别Electrode指Ag/AgCl电极和Pt电极，在膜片钳技术中，由于记录电极外被玻璃管，而参比电极（浴液电极）是裸露的，因此常指参比电极。Pipette指膜片钳电极，为拉制出的玻璃管，它不是真正意义上的电极，而是真正电极的依托。Microelectrode指细胞外记录电极。Micropipette指细胞内记录电极（包括全细胞记录电极）。离子通道电流（Ionchannelcurrent）指离子通道开启时离子跨膜流动产生的电流。离子流动方向取决于细胞膜内外离子浓度差和电学梯度。通道型受体通道开放时为受体电流，全细胞记录时为全细胞电流，单通道记录时为单通道电导（Conductance），单位是西门子（S）,常用pS，符号为G。Na-K泵产生的电流为泵电流，Na-Ca交换体电流为交换电流。输入漏电流（Inputleakagecurrent）理论上讲，不施加外部命令时，通过放大器探头的电流应该为0，如果由于放大器本身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于放大器的控制电流漂移的质量很高，一般漏电流都很小，几个pA。漏（减）电流（Leakcurrent）细胞膜的被动反应电流，为线性电流。封接电流（Sealcurrent）由于封接质量不高（没有形成良好的高阻封接），从封接处产生的电流。成为噪声。内向电流（Inwardcurrent）从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+）电流或从细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。外向电流（Outwardcurrent）从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。3.膜片钳系统中的电阻膜电阻（Membraneresistance,Rm）指脂质双分子层的跨膜电阻，反映离子是否容易穿透细胞膜。在细胞膜离子通道关闭时，Rm很大，可达几百MΩ。不同于膜电容，各种细胞的Rm变异较大。膜输入阻抗（Membraneinputresistance,Rin）对Rm的测量是通过对膜输入阻抗的测量间接得到的。给细胞膜施加一系列刺激方波，测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。注意要在形成全细胞记录时测定，在形成高阻封接时，Rin=Rseal。封接电阻（Sealresistance,Rseal）形成高阻封接时的电极电阻。高阻封接叫做“Gigaseal”，为1GΩ及以上的电阻，如果封接不良，则会产生封接电流。1KΩ=1,000Ω,1MΩ=1,000KΩ,1GΩ=1,000MΩ.1GΩ=109Ω.电极电阻（Pipetteresistance,Rp）电极由两部分组成，即圆桶形的杆部和圆锥形的尖端部。总的电极电阻可用下式表示：ρ为电极内液的电阻率，l为杆部长度；rs为圆锥形的起始半径（μm）；rt为电极尖端半径（μm）；φ为电极尖端圆锥形的角度。＋（－）Rp＝Rshank＋Rtip＝ρlπrs2ρcot(φ/2)πrtrs11串联电阻（Seriesresistance,Rs）和通路电阻（接触电阻）（Accessresistance,Ra）Ra是指有效电信号整个电路上的电阻。Rs是指流过电极尖端的电流所遇到的任何电阻。当将电极放入浴液中或在形成高阻封接时，Rs主要是电极电阻；全细胞记录模式形成后，Rs包括电极电阻Rp、破裂膜的残余膜片电阻、细胞内部电阻。后两者统称为通路电阻Ra，破裂膜的残余膜片电阻占Ra的主要成分。由于这些电阻在电学上是串联在一起的，故称串联电阻。Rs和Ra有时也互相通用。漏电阻（Leakrisistance,RL）又叫被动反应电阻（Passiveresistance），亦即稳态电阻（Steady-stateresistance）。是指细胞膜在某一钳制电位下离子通道恒定开启时细胞膜的阻抗。在不同的钳位电压下，RL是不同的。计算公式为：RL=ΔV/kΔI=ΔW/kΔDΔW是钳位电压与初始电压差，ΔD为上述情况的电流差。k为转换因子。4.膜片钳系统中的电容膜电容（Membranecapacitance,Cm）细胞膜的脂质双分子层是电的不良导体，因而由细胞外液-脂质双分子层-细胞内液就构成了细胞膜电容。Cm的大小与细胞膜表面积（包括内陷折叠部分）成正比，与脂质双分子层的厚度成反比。对于一个球形细胞，膜电容的计算公式为：Cm=πd2/100(pF)d为细胞直径（μm）。实际上由于有细胞膜内折（Infolding）的存在，Cm要比这大1.5-3倍。一般情况下，生物膜的电容大体都是1μF/cm2。跨壁电容（Transmuralcapacitance,Ct）电极浸液部分的内外液之间形成的电容，跨壁电容的介质为玻璃电极壁，因此，其为对细胞外液（浴液）电容。在膜片钳实验中其值可能很大，一般电极浸液深1mm会产生1pF或更大一些的电容。减小跨壁电容的方法：1.加厚电极管壁：采用厚壁玻璃毛坯拉制电极，或在电极浸液部分外部涂以硅胶树脂（Sylgard）等疏水性物质。2.减小电极浸液深度：浸液部分越大，Ct越大。3.补偿电路：即使采取了以上机械物理上的措施，仍会有残余的跨壁电容存在。因此可进一步采用膜片钳放大器内设的电容补偿电路进行补偿。漂浮电容（Straycapacitance,Cs）电极非浸液部分与邻近地表之间形成的电容以及电极夹持器、探头导线与邻近地表之间形成的电容等。又称寄生电容或杂散电容，为对地电容。Ca为缓冲运算放大器的输入端与大地及其自身电源、机壳之间的输入电容。CaCs}Ct电极电容（Pipettecapacitance,Cp）电极电容包括跨壁电容（Ct）、电极非浸液部分与邻近地表形成的漂浮电容（Cs）。在电压钳实验中，对电极电容进行补偿有几个目的：1.“美容”效果：电极电容的充放电电流搀杂在离子通道电流中；2.电极尖端的电压由于电极电容的充电而变化缓慢，快速激活的离子通道电流因而受到歪曲；3.如果电极电容没有进行正确补偿，将不能区分电极电容的充电电流与膜电容的充电电流，导致膜电容被过高估计。慢电容（Slowcapacitance,Cslow）与快电容（Fastcapacitance,Cfast）补偿输入端Rf电流输出端