DNA浓度和纯度的测定

DNA浓度和纯度的测定一、原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml寡核苷酸浓度约为30μg/ml（youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。二、材料、试剂及器具1、材料提取的PUC19样品、PUC19标准样品2、试剂灭菌重蒸水，TE缓冲液3、器皿石英比色皿；UV-240紫外分光光度计二、实验步骤1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.2、用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。3、设定狭缝后校零。4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。7、计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000方案二溴化乙锭法一、原理溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量给EB，而EB本身在302nm和366nm处有光吸收。吸收的能量在590nm处释放，并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。二、材料、试剂及器具1、标准DNA样品:已知浓度的线型DNA，以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。2、质粒DNA的酶切样品（待测）3、溴化乙锭（EB）5μg/ml：以PH8.0的TE稀释10mg/ml母液而的。4、紫外透射仪。三、操作步骤黑色塑料板（或其他替代物）↓在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴，每排六点↓取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀，则各点的DNA浓度分别为（单位：ng/μl）:20、15、10、5、2、1↓取待测样品经过梯度稀释后，各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀梯度稀释（单位：μl）↓把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上↓关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察每一点的荧光强度或拍照。比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度四、注意事项1、标准样品含单一种类的DNA，且大小与待测样品相近。2、待测样品和标准样品使用同样的体积.3、EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。4、沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。五、实验报告1、绘出所观察到的现象（以点的密度代表亮度）2、请估算待测DNA原液的浓度。要求记录测定原始数据，计算待测样品的浓度和纯度；并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想。琼脂糖凝胶电泳检测DNA采用1%的琼脂糖进行电泳，实验步骤为:a.制胶：称取0.2g琼脂糖转入三角瓶中，加入20mL1×TAE，混匀，于微波炉中加热融化。稍冷却后，加入1μLEB溶液（10mg/mL），倒入预先插入梳子的凝胶槽（12cm×12cm）内。待胶凝固后，竖直拔出梳子；b.上样：在水平电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，将凝胶槽转移到电泳槽（HE-120，上海天能科技有限公司）中，保证缓冲液的液面高于凝胶表面。在封口膜上将5μLDNA样品和1μL6×loadingbuffer混合均匀，然后小心的加入到凝胶的点样孔中。Marker为λDNA/HindIII，上样量为5μL。c.跑胶：确认样品孔所在的一侧为阴极，打开电泳仪（EPS-300，上海天能），设定电压为85V进行跑胶。d.凝胶成像：待溴酚蓝迁移到终端时停止电泳。在凝胶成像系统（Bio-radGelDocXR，美国伯乐公司）的紫外光下观察并拍照。