凯氏定氮

蚀凯氏定氮实验报告蝿莇一实验目的螂1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。肁2、掌握凯氏定氮法的操作技术和凯氏定氮仪的使用方法。蒁二实验原理肆蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25g蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。这种测定方法就叫做凯氏定氮法，也称克氏定氮。凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量生物样品中的含氮量可用以下反应来测定：袂消化：样品与浓硫酸共热时，浓硫酸是有机物脱水，其中的碳、氢二元素被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质分解出的氨进一步与硫酸作用生成硫酸铵，反应式如下：蒂有机物（C、H、O、N、P、S）+浓H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H3PO4衿此消化反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，加速有机物分解，反应式如下：袅K2SO4+H2SO4=2KHSO4羂2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3袃2CuSO4Cu2SO4+SO2+O2袈Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H2O+SO2薁△肂样品消化后，要使其中硫酸铵中的氨游离出来，浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，可借助水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中的氢离子浓度降低；然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)即可计算出待测样品中的氮含量。羀蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，反应方程式如下：肈铵盐的分解：(NH4)2SO4(aq)+2NaOH→Na2SO4(aq)+2H2O(l)+2NH3(g)蚆氨的固定：2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O膂滴定：待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止（即滴定至紫红色)，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的氮量。滴定时用甲基蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH4H2BO3的蓝/绿色滴至原来H3BO3的颜色即为终点。反应方程式如下：莀返滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3螀本法适用范围0.2~1.0mg氮，相对误差应小于2%。蒅若样品中除有蛋白质外，沿有其他含氮物，则采取以下措施：首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未知加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的离心上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量及总氮量，从而计算出蛋白氮量。蒆三实验器材螁凯氏烧瓶（×2），小漏斗，滴管，容量瓶（100ml×2），凯氏定氮仪，锥形瓶100ml×3，烧杯，量筒（10mL），移液管（5ml×2,2ml×3）；5mL微量滴定管，电炉，沸石，吸耳球等。芈四实验试剂蒈2ml卵清蛋白样品，4ml浓硫酸，200mg硫酸钾-硫酸铜混合物，双氧水，50%氢氧化钠溶液2%硼酸溶液（混合指示剂），0.00963mol/l标准盐酸溶液，0.3mgN/ml标准硫酸铵溶液，蒸馏水。薆五操作膂1、将凯氏定氮仪器的装置仪器安装好。羀2、样品的消化：芇将一定量的蛋清按1：1的比例与水混合，取两个50ml凯氏烧瓶编号。一只烧瓶内加入适当混合好的蛋清溶液2ml，然后再依次加入浓硫酸2.0mL及硫酸钾-硫酸铜混合物200mg。另一只烧瓶作为空白对照，其内加入蒸馏水2mL，然后再依次加入浓硫酸2.0mL及硫酸钾-硫酸铜混合物200mg。烧瓶口插入一小漏斗（做冷凝用），将烧瓶置于通风厨内的电炉上加热消化。消化至淡黄色时，冷却，加入双氧水数滴，继续加热至淡蓝色，冷却，定容至100ml。蚅3、仪器的洗涤：薃首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入硫酸使其保持酸性（烧瓶中溶液应呈红色），以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石，以防爆沸。打开电炉，开始加热。蒸汽发生器产生的蒸汽进入反应室5，将其中的氨带出，之后进入冷凝管，冷凝后经出口进入吸收瓶中。自来水通入冷凝器8，将蒸汽冷凝。操作时打开冷凝水，打开电炉进行加热，加热一段时间后，反应室5中出现液体。莈羆由4处沿玻杯壁加入蒸馏水约10ml~20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。切断电源，用夹子夹住反应室与蒸馏烧瓶间的橡皮管，此时反应室内液体被压入反应室外层，此即对仪器进行洗涤，当反应室外层的溶液过多时，由7处放出废液。洗涤数次后，在9处放上另一个盛有5ml硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将锥形瓶倾斜，以保证冷凝管末端完全浸入液体内。继续蒸馏5min。观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色，或颜色变浅，则表明反应室内部已洗干净。移动锥形瓶使混合液离开管口约1cm，继续通气1min，最后用水冲洗管口外，准备蒸馏。螅4、蒸馏螀⑴预实验：膀由4处向反应室内加入2ml标准硫酸铵溶液与10ml氢氧化钠溶液，但氢氧化钠溶液不要放光，塞上玻璃塞，保持密封。在加入反应物氢氧化钠之前，即用加有5ml硼酸-指示剂混合液的锥形瓶接收冷凝出的溶液，倾斜锥形瓶，将冷凝管末端完全浸没在溶液中，待硼酸指示剂变绿后，开始计时，3min后，将锥形瓶移开，使冷凝管末端距离液面1cm，继续蒸馏1min，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周，移去锥形瓶，用表面皿覆盖，进行滴定。平行三组，每做完一组，都要用蒸馏水洗涤反应室，方法同步骤3。然后用2ml蒸馏水代替2ml标准硫酸铵溶液，进行测定，检测蒸馏水中是否含有微量氮，平行测定三次。螅⑵样品测定袅用2ml蛋白样品溶液代替标准硫酸铵溶液加入反应室中，其他操作同预实验，测定样品中的含氮量，同时也要测定空白消化液中的含氮量，即用2ml空白消化液代替样品溶液加入反应室中，测定样品中除蛋清外加入的其他溶液（蒸馏水，双氧水等）中是否含有微量氮。平行测定三次。膁5、滴定薈用0.00963mol/lHCl溶液滴定锥形瓶中硼酸液至其呈淡葡萄紫色，记录所消耗的HCl溶液量。螈6、计算袅14.008100cABmV薂m：样品中的氮含量，即100ml样品中含氮量（mg）芀A：滴定样品消耗的HCl溶液的体积（ml）薇B：滴定空白消耗的HCl溶液的体积（ml）羅V：相当于未稀释样品的体积（ml）羃c：盐酸的物质的量浓度（mol/L）螇14.008：没摩尔氮原子质量（g/mol）莅100：100ml样品肅计算所得结果为样品总量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品蛋白氮乘以6.25。聿六实验结果与分析葿1、实验结果记录如下：肄表1实验结果数据记录表2、数据处理：⑴标准硫酸铵溶液氮含量测定膅平行组蒀项目羇1膇2芅3袁平均虿标准硫酸铵溶液（ml）袆4.34莄4.36节4.31肇4.34蚅空白（蒸馏水）（ml）蒄0蚃0蝿0螈0蒄蛋白样品（ml）螀2.35薁2.39蒇2.32薄2.35膁空白（ml）罿0000由滴定结果知：A=4.34ml;B=0ml那么：A-B=4.34ml。又已知c=0.00963mol/L，V=2ml带入公式331014.00810cABmV可得，m=0.2968mgN/ml⑵卵清蛋白样品氮含量的测定由滴定结果：A=2.35ml;B=0ml，那么：A-B=2.35ml。又已知c=0.00963mol/L，测定时加入样品液体积为V=2ml样品稀释至100ml带入公式331014.00810100cABmV可得m=15.87mgN，也就是未稀释的1ml卵清蛋白的中含氮15.87mgN，那么卵清蛋白的含氮量是15.87mg/ml，也就是1.587g/100ml则稀释的卵清的蛋白质含量为M=m×6.25=99.21mg/ml，也就是9.921g/100ml3、结果分析测定标准硫酸铵和空白的目的是为了验证装置有没有洗干净和进一步熟悉实验操作。由结果可以看出，两组空白对照中含氮量均为零。标准硫酸铵溶液中氮的实际含量为0.3mgN/ml，而在预实验中测得的结果为0.2968mgN/ml，相对误差为1.07%。由对标准硫酸铵溶液的氮含量的测定结果看，测定结果相近，说明已掌握实验技巧，能够较准确的判断滴定终点。从表一中还可以看出每次平行实验中，测定所得的结果并不相同而是有一定偏差。引起误差的原因为：在仪器洗涤过程中，虽然接收瓶内指示剂不变色，但指示剂的变色有一定的变色范围，也就使实验过程中的仪器内含有少量的含氮类物质，造成了一定的误差；滴定误差过程中，实验的滴定终点的颜色的判断会引入一定的误差；在向反应室内加NaOH溶液时，开口过大，或加液后没有液封，会使一部分氨气逃出，带来实验误差；盐酸容易挥发，可能使滴定结果偏大。七讨论1、本次实验中采用的凯氏定氮法在物质蛋白含量的测定中运用比较广泛。凯氏法的优点是适用范围广，其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。此外凯氏定氮法也存在着其他一些不足之处，如消化时间长、环境污染大、滴定终点不易控制等。2、消化这一步的目的是将必须先将有机化合物中的氮元素以铵的形式转化出来。在这一步中，加入硫酸钾是为了提高中间产物的沸点（从169℃到189℃），硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。使用这种方法，样品分解过程的终点很好判断，因为这时混合物会变得无色且透明。而在操作中加入过氧化氢溶液的目的是促进氧化。在此操作过程中要注意：⑴样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上，否则造成实验结果偏低，所以加固体时，可以用纸片叠成槽状，送至烧瓶底部；⑵先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上，这些都会影响测量结果。如果不小心出现了上述情况，应尽量将其用消化液冲洗下；⑶要在试管口放置小漏斗，起回流作用；⑷在消化过程中要随时转动烧瓶，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失，以保证样品完全消化；⑸消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此整个消化过程均应在通风橱中进行；⑹空白组和样品组要用标签标记清楚，不要互混。3、反应室中使硫酸铵与氢氧化钠反应，释放出氨气，通过蒸馏过程，利用蒸汽气流将氨气带出，于冷凝管口处用盛有硼酸指示剂的锥形瓶接收，由于混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在酸性溶液中呈红色，所以在吸收了一定量的氨气后，锥形瓶中溶液变绿。最后再用浓度已知浓度盐酸反滴定，溶液变为浅红色时，滴定到达终点。然后用已知浓度的盐酸溶液反滴定，进而确定含氮量。在此操作过程中应注意：⑴为了防止倒吸现象，蒸馏时需控制火力；⑵不要将氢氧化钠溶液全部放入反应室中，要留一部分起到密封作用，防止氨气溢出。同时一定要轻轻转动加样口上的盖子，不可将开口打的过开，否则，不但会使一部分氨气逃出，带来实验误差，还容易出现倒吸现象，使实验失败；⑶蒸馏吸收时应在加液前就应使硼酸接受气体，待变色后三分钟移开使液面离出气口部1cm继续吸收1min，最后要用蒸馏水冲洗管口；⑷加入样品液时，要尽量将移液管口插入其内，避免其残留在壁上；⑸在将溶液加入反应室之前，要尽量排空其内的水；⑹吸收过氨气的锥形瓶若不立即滴定，需用培养皿或平皿加盖，否则其中氨气挥发，影响滴定结果，造成误差；⑺此次实验中使用的碱式滴定管直径小，应利用洗耳球将标准HCl溶液吸入，