膜亲和过滤法

第七章膜亲和过滤法亲和分离技术被认为是解决生物工程下游产品回收和纯化的高效方法。亲和分配、亲和沉淀、亲和色谱等技术正在迅速发展，其中亲和色谱已成为色谱领域中的一个重要分支，它的选择性和特异性极强，是其他技术无法比拟的，但填充亲和色谱柱技术在发展中遇到某些固有限制，如流速低、填充颗粒的压缩、扩散传递慢，故造成柱效率不高并且不易大规模应用为了弥补上述不足，自80年代中期以来，已有人把这两种技术有机地结合起来，发挥各自的长处，于是出现了膜亲和过滤方法。这一方法实际上包括两个分支：①亲和膜分离技术，制备了带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；②亲和-错流膜过滤，将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。7.1亲和膜分离技术亲和膜分离首要的是研制出一种有效地用于生物大分子纯化分离的“亲和膜”（AffinityMembrane，简称AM）。制备亲和膜的关键是要选择合适的膜材料，并对膜进行表面化学改性有人称：“膜表面改性技术领导膜进入90年代”；“未来的十年将是产生新的更为先进的第三、第四代膜的时代”。7.1.1基本过程和操作方式亲和膜的分离过程①分离膜的改性②亲和膜制备③亲和络合④洗脱⑤亲和膜再生实现膜上亲和分离需解决的几个关键问题①膜表面要有足够多并可利用的化学基团，使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基-OH，-NH2，-SH或-COOH②要有足够数量可利用的化学基团则必须有足够高的表面积，要便于让生物大分子自由地出入膜，必须有足够大的孔径③孔分布应窄而均匀，以获得高的通透量和分离效能④加压操作，膜具有一定的机械强度⑤亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度的缓冲液和有机溶剂亲和膜的分离操作方式①亲和超滤过程②微孔亲和膜过滤过程亲和膜组件的形式有板式、圆盘式、中空纤维式等7.1.2基本理论由于亲和膜分离过程非常复杂，故到目前为止真正基于物理-化学-生物特异性相互作用的理论关系式还未建立，最初基于配基-蛋白质相互作用的吸附—解离平衡过程所提出的亲和模型有一定的局限性有人用对流、扩散和Langmuir吸附理论对亲和膜分离过程作了数学分析，推导了蛋白质和配基之间形成的络合物浓度与蛋白质浓度和配基浓度之间的关系式31Re09.1643ScDDkPcABBAkk12tczcDzcvtcS122sssckcccktc211SCmCPeCC221SSSCrmnCCmnC11nTnrrnTnJnTrnJnTrnJC/11exp/,1,/,/1111crKTddyIyyxJx2expexp1,007.1.3基质材料亲和膜分离技术要得到发展并获得应用的必要前提之一，是要制备出能对生物活性物质如蛋白质、酶等能有效地进行固载化的基质膜材料。在亲和分离中使用的基质材料有纤维素及其衍生物，聚酰胺（PA）及其衍生物，聚丙烯酰胺及其衍生物，羟乙基甲基丙烯酸酯，感动羟甲基酰胺、聚砜等可通过活化或改性等手段与蛋白相结合或固载上酶组成亲和膜聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷等也有可能成为亲和膜材料，甚至某些无机材料，如大孔硅胶，氧化铝等，也能制成亲和膜或作为添加剂7.2亲和膜分离技术的应用IgG的亲和膜分离过程举例①起始膜材料的选择动物细胞的尺寸大于10μm蛋白质的尺寸一般都小于0.01μm故选用0.65μm的微孔膜来载留细胞而透过蛋白质②膜的表面处理聚砜类的微孔膜表面改性使之亲水化羟基转化为活泼基团(表氯醇法活化羟基)③接配基反应方法有溴化氰活化法、高碘酸氧化法和表氯醇法④具体操作过程第一步将细胞培养液或小鼠IgG单抗液（pH调至8.0）引入孔纤维A蛋白亲和膜的管程，在管中做切向流（错流）过滤，亲和吸附和过滤同时进行。第二步淋洗，用pH8.0的磷酸盐缓冲液溶液（PBS）洗膜除去膜杂质。第三步洗脱，用pH3.5的柠檬酸缓冲液将膜上A蛋白吸附的单抗解吸下来。第四步再生，用pH8.0的PBS洗膜，以利下一欠吸附操作。亲和膜分离技术从分离性能上看有两个明显的特点：①兼过滤和亲和吸附于一身，分离速度快；②产物在流以膜孔的过程中被孔臂上的配基所吸附，不存在像多孔颗粒中那样的孔内扩散控制、故宏观吸附速度快。7.3亲和-膜过滤亲和膜过滤又称亲和过滤（AffinityFiltration）或亲和超滤（AffinityCross-FlowFilration简称ACFF），是1981年由Hedda等人首先提出并得到迅速发展的一中新型大规模分离纯化技术。这一技术是生物化学、化学工程和生物工程等多门学科的前沿交叉点，它将亲和层析和膜过滤特别是超滤技术有机地结合起来，兼有亲和层析和膜过滤的优点，从而成为目前研究的热点7.3.1亲和-膜过滤的特点因为亲和-膜过滤是亲和层析与膜过滤相结合的技术，所以先分别简要介绍一下这两者的优缺点亲和层析膜分离技术亲和-膜过滤特点7.3.2亲和-膜过滤过程及其关键问题亲和-膜过滤的“主角”是一种做“亲和载体”的粒子（AffinityEscort）。–亲和载体的结构包括一个由生物分子无特异吸附性的物质组成的内核以及内核表面上连接的某些特定基团，这些基团必须对所提取的蛋白质有一定的特异吸附性。–亲和载体一般必须拥有以下两种特性之一或能溶于水溶液，或易于悬浮在水溶液中。亲和载体的制备通常有两种途径–当用不溶于水的粒子作为亲和载体的内核时，载体所能吸附的最大蛋白量受粒子表面积的限制–以水溶性物质作为亲和载体内核与非水溶性内核相比，由于它分散在水相中7.3.3亲和-膜过滤技术的基本理论亲和作用的一般理论渗透理论亲和-错流过滤模型第一步是吸附质被亲和载体所吸附第二步是洗涤7.3.4亲和-膜过滤的应用纯化Δ5-4酮甾醇异构酶从胰酶和胰凝乳蛋白酶混合物中纯化胰酶从酵母提取物中提取乙醇脱氢酶除此外，亲和-膜过滤还可用于β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、辣根过氧化酶、IgG等的分离提取