高效液相色谱方法的验证

高效液相色谱方法的验证高效液相色谱方法的验证••方法验证的目的方法验证的目的••方法验证的内容方法验证的内容••方法验证的项目及测定方法方法验证的项目及测定方法方法验证的目的方法验证的目的目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。项目会有不同的验证要求。方法验证的内容方法验证的内容••准确度准确度••精密度精密度••专属性专属性••检测限检测限••定量限定量限••线性和范围线性和范围••耐用性耐用性准确度准确度定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%%表示。表示。1.1.主成分含量测定主成分含量测定原料药：对照品或方法比对原料药：对照品或方法比对制剂、中药：标准加样回收制剂、中药：标准加样回收2.2.杂质定量杂质定量杂质对照品杂质对照品方法比对方法比对杂质与主成分的相对含量杂质与主成分的相对含量%100%×-=BAC回收率回收率A:A:试验供试品中被测成分的量试验供试品中被测成分的量（通常为含量测定量的（通常为含量测定量的50%50%））B:B:试验供试品中加入的对照品的量试验供试品中加入的对照品的量（通常为（通常为±±20%20%））C:C:试验测定值试验测定值测定：加样回收（测定：加样回收（nn³³99））精密度精密度定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差1.1.重复性（重复性（nn³³99））2.2.中间精密度中间精密度3.3.重复性重复性测定：测定：HPLCHPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计33个浓度，个浓度，分别平行制备分别平行制备33份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备备66份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。同一份供试品连续进样同一份供试品连续进样66次，计算得到的相对标准偏差只能表征进次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。样精密度，不能作为方法精密度。专属性专属性定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。1.1.鉴别反应鉴别反应2.2.含量测定含量测定杂质测定杂质测定限量检查限量检查测定：测定：空白制剂，模拟复方空白制剂，模拟复方加速破坏试样测试加速破坏试样测试DADDAD峰纯度检查峰纯度检查检测限和定量限检测限和定量限检测限（检测限（LODLOD）：）：供试品中被测物能被检测出的最低量。供试品中被测物能被检测出的最低量。通常采用信噪比通常采用信噪比3:13:1或或2:12:1定量限（定量限（LOQLOQ））::供试品中被测物能被定量测定的最低量。供试品中被测物能被定量测定的最低量。通常采用信噪比通常采用信噪比10:110:1测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应色谱峰高色谱峰高hhpp和平均基线噪音（和平均基线噪音（hhbaselinenoisebaselinenoise））之比。通常报告进样质量之比。通常报告进样质量或进样体积（需与样品制备方法相关）。或进样体积（需与样品制备方法相关）。hhNSisebaselinenoP=线性和范围线性和范围线性：在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关线性：在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。系的程度。测定：测定：至少至少55个浓度个浓度（（nn³³55）），，每个浓度进样每个浓度进样33次，以次，以33次进样的平均次进样的平均峰面积对样品浓度进行线性回归。峰面积对样品浓度进行线性回归。范围：范围：在能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限在能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。浓度或量的区间。耐用性耐用性定义：在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。定义：在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。测定：测定：供试品溶液的稳定性（溶剂，温度，时间等）供试品溶液的稳定性（溶剂，温度，时间等）进样量进样量流动相组成比例，流动相组成比例，pHpH不同牌号的同类型色谱柱，柱温，流速不同牌号的同类型色谱柱，柱温，流速检测波长（最大吸收波长位移范围，及吸收强度的变化等）检测波长（最大吸收波长位移范围，及吸收强度的变化等）分析方法研究和验证中使用的标准物质分析方法研究和验证中使用的标准物质••对照品（一级标准）对照品（一级标准）••工作标准（二级标准）工作标准（二级标准）••非法定对照品非法定对照品杂质分析杂质分析新原料药和新制剂中的杂质研究新原料药和新制剂中的杂质研究国家有关新药申报要求国家有关新药申报要求ICHICH文本：文本：Q3A,Q3BQ3A,Q3B••采用对照品，或相对保留时间定位采用对照品，或相对保留时间定位••采用采用DADDAD或或MWDMWD确定确定UVUV光谱或不同波长的检测情况光谱或不同波长的检测情况••测定对主成分的相对响应因子（测定对主成分的相对响应因子（0.9~1.10.9~1.1））仪器要求：仪器要求：1.1.检测灵敏度：波长，灯检测灵敏度：波长，灯能量，流通池，进样量能量，流通池，进样量等其它色谱条件等其它色谱条件2.2.数据处理：积分参数数据处理：积分参数