鸡传染性支气管炎病毒的研究进展

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鸡传染性支气管炎病毒的研究进展鸡传染性支气管炎(AvianInfectiousBronchitis,IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染病,它主要侵害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。本病呈世界性分布,对养鸡业的危害极大,它能使成鸡的增重和饲料报酬降低,鸡蛋的产量、质量和孵化率下降,并直接导致雏鸡死亡、肾脏病变和输卵管永久性退化;另外,IB还经常做为病因之一参与混合感染,例如诱发慢性呼吸道病(CRD)的爆发,近年来,该病的流行呈上升趋势,尤其肾病变型IB已蔓延至全国各养鸡地区,造成了严重的经济损失。本病最早由美国Schalk和Hawn报道,临床以患鸡咳嗽、喷嚏和气管哕音的呼吸道症状为主,之后陆续在世界各国发生,1936年Beach和Schalm确定病原为病毒(呼吸型IBV),后命名为鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus,IBV),归入冠状病毒科,是冠状病毒的代表株。1972年邝荣禄等首次在广东证实我国也有该病发生。传染性支气管炎病毒血清型较多,常见的有Massachussetts、Connecticat、lowa97、Iowa609、Hotle、JMK、Clark333、SEl7、Florida、Arkanass99和Australian“T”。1962年Wintefield等首次报道了肾型IBV,可引起肾脏肿大、尿酸盐沉积等症状。1986年E1Houadfi等在摩洛哥首次分离到以G株为代表的嗜肠型IBV,主要引起呼吸道、肾脏及肠道病变。Gough等首先报道了英国存在一种新的特殊IBV血清型793/B,而来自西班牙、德国、希腊和墨西哥可疑血清样本中亦可发现抗此血清型IBV的特异性抗体,法国、荷兰、意大利、泰国等均有此血清型IBV的存在。IBV基因组核酸RNA复制的不连续机制及RNA聚合酶的不完全校对机制,使得病毒RNA在复制过程中易发生基因点突变、插入、缺失或重组,造成大量IBV变异株的出现,目前世界上已分离到的IB血清型已达30种之多,不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用,IB的多血清型性为其免疫预防增加了难度。1IBV的基因组鸡传染性支气管炎病毒是正链单股RNA病毒,直径为90~200nm,是所有RNA病毒中最大的,蔗糖浮密度值常在1.15~1.18g/ml范围内,病毒有囊膜,表面有间距较宽、呈放射性排列的杆状纤突,长约20nm,使病毒外观近似皇冠,纤突不稳定,易从病毒粒子上脱落,当离心力超过100000r/min,甚至有时在37℃孵育,都会导致某些纤突成分的丢失,IBV是第一个测定了基因组全部序列的冠状病毒,长27~30kh,有感染性,5′末端为“帽子”结构,3′末端含有共价结合的poly(A)尾,至少有10个明显的开放阅读框架(ORF),编码分子量6.7~440kDa蛋白,病毒RNA各基因的定位次序如下:5’-F1-F2-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-Npoly(A)-3′。Boursnell等完成了对IBV-Beaudene株全基因组的测序,共有27608个核苷酸组成,不同IBV毒株的基因组长度略有差异。lBV被分为6个区域,由小到大分别被命名为MrnaA~F。IBV含三种最主要特异性蛋白:纤突蛋白(SpikeGlycoprotein,SGP,即S蛋白)、膜蛋白(MembraneGlycoprotein,MGP,即M蛋白)、核衣壳蛋白(NucleocapsidProtein,NP,即N蛋白),分别由mRNAE、C、A编码,三种结构蛋白的摩尔比为1:6:15,第四种小膜蛋白(sM)与病毒囊膜有关。病毒的血清型、血凝抑制和大多数的中和抗体均由S1蛋白决定和诱导。2IBV的主要结构蛋白及功能2.1纤突蛋白(S)S蛋白由mRNAB编码,位于病毒粒子最表层的囊膜上,是构成病毒纤突的主要成分,是由2~3个相同的单体非共价连接构成的聚合物。S蛋白包含两种糖多肽S1和S2,具有非常重要的生物学功能:①S蛋白与宿主细胞膜上二糖蛋白受体的结合,使IBV吸附在宿主细胞上,只有S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为Sl和S2两条糖多肽时,病毒囊膜才有融细胞膜的活性;②可诱导血凝抑制抗体和中和抗体(VN);③S1蛋白的氨基N端决定IBV毒株的组织亲和性及其毒力;④S1蛋白是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白;⑤S2糖蛋白可诱发较弱的中和抗体,有免疫优势,并在大多数IBV毒株保守,可作为IBV疫苗。2.2膜蛋白(M)M蛋白是一种跨膜蛋白,它是IBV粒子中含量最多的糖蛋白,M蛋白由mRNAD所编码,M蛋白的N端位于病毒离子外部并被糖基化。M蛋白具有控制并介导病毒粒子从粗面内质网膜或高尔基体膜出芽,在病毒装配时与核衣壳相互作用,并将核衣壳结合到囊膜上的作用。对M蛋白的研究还发现,与核衣壳蛋白和纤突蛋白相比,其免疫原性最低。然而,也有报道认为M蛋白上存在着重要免疫原性的抗原决定簇,但其免疫生物学功能,尤其是该蛋白在病毒致病过程中的作用及其与病毒的组织嗜性的关系还需要进一步研究。2.3核衣壳蛋白(N蛋白)核衣壳蛋白是唯一位于病毒内部的结构蛋白,位于囊膜内与基因组RNA紧密结合形成的核衣壳上,分子量为46kDa,由409个AA组成,被磷酸化,占病毒蛋白总量的40%,氨基酸中约有17%为碱性核苷酸,在整个基因组的进化过程中相对最为保守。N蛋白在病毒复制、组装中有重要作用。N蛋白与前导RNA序列相互作用有助于病毒mRNA合成和病毒RNA结合形成螺旋状核衣壳,使之容易装入病毒壳内。随着病毒蛋白结合到基因组RNA包装信号序列,N蛋白可能以协同方式结合到RNA重复位点,指导整个基因组的包装。N蛋白还是免疫识别相关靶位,在细胞免疫免疫和体液免疫中起重要作用。据Koch等的报道,针对IBVN蛋白的单抗具有病毒中和活性,表明在IBV感染细胞表面可表达N蛋白或其片断,N蛋白在对IBV免疫应答中起作用。Boots等研究编码N蛋白重组脱氧核糖核酸的免疫性发现:用表达的融合蛋白首先免疫小鼠和鸡。均能引起对IBV完整病毒粒子的免疫应答,Sang等对IBV核蛋白的结构和功能进行深入研究后的结果表明,在N蛋白C-末端前120个氨基酸为CTL抗原表位,可诱导细胞毒性T细胞反应,并对急性感染的雏鸡具有保护作用,可见,IBV核蛋白具有重要的细胞免疫功能。2.4其它蛋白近年来,mRNAB、D、F被确认为是具有编码功能的多顺反子,Smith等将mRNAD的第3个ORF在细菌中表达,得到了1个12.4kDa蛋白,与mRNAD第3个ORf编码蛋白的分子量相同,制取12.4kDa蛋白的抗血清,可从被IBV感染的Vero细胞中沉淀出1个12.4kDa,说明病毒粒子当中确实存在mRNAD,第3个ORF的产物。Liu等体外表达同一条mRNAD可翻译出3个蛋白质(6.7kDa、7.4kDa、12.4kDa),这3条蛋白可在IBV粒子中检测到,其中12.4kDa蛋白可能与病毒囊膜连在一起,可能与病毒复制有关,Liu等用同样方法证明mRNAB可在体外翻译出2个蛋白质(7.5kDa、9.5kDa),这些蛋白质同样可在IBV感染细胞上检测到,其中7.5kDa的蛋白由65个氨基酸组成,亮氨酸占26%(17个),有明显的疏水性,这表明它可能与病毒囊膜相连,9.5kDa蛋白功能尚不清楚。后经同样的方式,RNAF也被证实为具有编码功能的多顺反子。3IBV的复制IBV的复制严格在受感染细胞的胞浆内完成。首先,在pH近中性条件下,IBV通过囊膜上的S糖蛋白与靶细胞膜上的特异受体相接触而吸附在细胞表面,然后细胞膜与病毒囊膜融合使IBV核酸RNA进入宿主细胞浆,随后病毒基因组RNA与核糖体结合,以便从5′端翻译出IBV特异的依赖于RNA的早期RNA聚合酶,在IBV基因组中,最靠近5′端的两个大ORF可能与此有关。该RNA聚合酶使病毒的正链基因组RNA转录出一条全长的互补负链RNA,其5′端有poly(U)序列。以负链RNA为模板通过两个不同的晚期RNA聚合酶又进一步转录出新的正链基因组RNA(mRNAF)和一套5个亚基因组mRNA(mRNAE~A),它们5′端和3′端分别有“帽子”和“poly(A)”结构,长度逐渐减小。mRNAE、C、A在5′端特殊区(即比其小的mRNA中不存在的序列)中各自含有单一的ORF,因此是功能性单顺反子mRNA,分别编码S蛋白、M蛋白和N蛋白。而mRNAF、D、B的5′端特殊区均含有一个以上的ORF,这说明它们是功能性多顺反子,mRNAF为新的正链基因组RNA(mRNA),它与原基因组RNA等长,是以负链RNA为模板拷贝下来的,其合成从负链RNA3′端开始,但启动子或先导RNA的延长却是从负链RNA上内部特异性位点开始的,涉及naRNAF合成的依赖RNA的RNA聚合酶与合成负链RNA的RNA聚合酶不同,主要表现在前者需要先导RNA作为引物。mRNA含三个ORF(3a、3b、3c),它们分别编码6.7kDa、7.4kDa和12.4kDa多肽,其中3a的保守性(包括位置、长度、序列)最好,而3b和3c的序列变异程度较大。由于IBV各毒株内均存在这三个ORF,所以mRNA3可能编码一些以前未曾确定的病毒多肽,是一种功能性三顺反子,在病毒复制中发挥作用。与mRNA3相似,mRNA5也是一种功能性多顺反子,含两个ORF(5a和5b),分别编码7.4kDa和9.5kDa多肽,5a和5b编码的多肽有何作用尚不清楚。根据Kozak的渗漏扫描(LeakyScanning)机制,在翻译起始邻近序列5′-GCCA/GCCAUGG中,-3和+4位的瞟呤碱基对核糖体识别AUG这一翻译起始信号的效率很重要(一般-3和+4位分别为A和G),若AUG邻近序列不是最佳,则部分核糖体可能在该处不起动,而向下游搜寻处于最佳序列的AUG,但IBVmRNA的翻译机制与上述规则略有不同。例如,Binns等曾报道,mRNA中5a的起始序列(-3和+4位分别为A和G)虽然比5b(-3和+4位分别为G和A)优越,但试验结果却表现5b的表达较5a容易。大多数真核生物的mRNA仅编码单一蛋白,为单顺反子mRNA,而近年来不断发现许多动物病毒可编码双或多顺反子mRNA,例如IBV的mRNA3和mRNA5等,它们的翻译方式与单顺反子不太一样,对其产生机制及表达产物的功能正在研究中。IBV的结构及非结构蛋白可能通过两个阶段,分别按不同机制翻译和调节,在结构蛋白中,N蛋白产生于细胞质的多核糖体上,经磷酸化后与新合成的基因组RNA相互形成螺旋状的核衣壳,M糖蛋白的合成发生与RER膜结合的多糖体上,其产物在开始后5min,才能依赖信号识别子对某个内部信号序列的识别而被插入RER膜,糖基化的过程则要等多肽转运到高尔基体后才能进行。S糖蛋白虽然也在RER膜结合的多核糖体上合成,但它与M蛋白明显不同,表现为:①由于氨基酸带有信号序列,所以多肽合成后,马上就边翻译边插入RER膜;②N-糖基化过程与翻译同时进行。S蛋白在RER膜上装配成多聚体纤突后,在高尔基体中参与毒粒合成。过剩的S蛋白则被转运并插入到宿主细胞膜。S蛋白在翻译后将被宿主细胞的蛋白酶切为S1和S2两个糖多肽,这个过程发生在哪个细胞器还不是很清楚,但最近有证据表明,高尔基体或细胞膜是最有可能的部位。一般来说,不经过切割的S蛋白缺乏激活病毒溶细胞活性的能力。由于M蛋白只在高尔基体积累,所以IBV新合成的毒粒也仅从那里出芽。在出芽部位,宿主细胞蛋白不断被病毒糖蛋白排斥而取代,同时,螺旋状核衣壳链按顺序排列到膜上含病毒糖蛋白的地方。S蛋白对毒粒装配不起主要作用,因为通过衣霉素(tunicamycin)阻断其合成后,仍有含正常量的核衣壳蛋白和M蛋白的毒粒产生。完整毒粒在高尔基体经过修饰后,被包入滑囊囊泡(Smoothwalled)中,释放到细胞浆内,一些有囊膜的病毒可能通过这样的方法躲避宿主免疫系统的防疫机制,长期存在于宿主体内(因为囊膜与免疫系统是隔绝的)。毒粒的释放有两种方式,一是从裂解的感染细胞中直接释放;二是含毒粒的囊泡被转运到细胞边缘,在这里通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