抗菌肽作用机制

抗菌肽作用机制的研究进展卢亚丽(河南工业大学，河南，郑州，450001)摘要:抗菌肽是一类来源于多种生物的多肽,这类活性多肽多数具有分子量小、强碱性、热稳定性及广谱抗菌的特点，还可以抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫，且不易产生抗药性。是先天免疫的重要防御物质，良好的应用前景。该文分别对抗菌肽的抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫的生物活性和作用机理进行了综述，并指出了在开发研究抗菌肽中存在的问题，对其发展作了展望。关键词：抗菌肽，生物活性，作用机制ResearchProgressonMechanismofAntimicrobialPeptidesLUYa-li(HenanUniversityofTechnology,Henan,Zhengzhou,450001)AbstractAntimicrobialpeptidesareaclassofpeptidesderivedfromavarietyoforganisms.Theyhavemanyadvantages,suchassmallmolecularweight,strongalkali,broad-spectrumantimicrobial,goodthermalstability.Moreover,antimicrobialpeptidesalsohavethecharacteristicswithanti-fungal,anti-tumor,anti-virus,anti-parasitic,andlessdrugresistancegenerated.Theyareimportantinnateimmunedefensematerial,andhaveagoodapplicationprospect.Inthispaper,thebiologicalactivityandmechanismofactionofantibacterial,antifungal,antitumor,antiviral,antiparasiticwerereviewed,andthetheproblemsexistedintheresearchofantibacterialpeptideswerepointedout,aswellastheprospectsofdevelopmentofantibacterialpeptides.Keywords：antimicrobialpeptides,biologicalactivity,mechanism抗菌肽(antibacterialpeptides)也称抗微生物肽、肽类抗生素或天然抗生素,是自然界中普遍存在的一类阳离子活性多肽,在细菌、植物、昆虫、鱼类、两栖类和哺乳动物中均有分布，是在诱导条件下由动物免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性阳离子肽类活性物质,抗菌肽具有抵御外界微生物侵害,清除体内突变细胞,是生物天然的、非特异性防御系统的重要组成部分[1]。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌，还可以抗真菌、抗肿瘤、抗病毒,且不易产生抗药性[2]等特点。近年来，抗生素的广泛使用造成了多药耐药菌感染在临床的蔓延，因而抗菌肽低耐药性在预防与治疗耐药菌感染方面具有广阔的应用前景，随着分子生物学技术的发展,抗菌肽已成为近年来分子免疫学和分子生物学的研究热点。文中就近年来抗菌肽作用机制的研究进展进行阐述。1抗菌肽的概述1.1抗菌肽的生物活性抗菌肽之所以被冠上“抗菌”这两个字,主要是因为其抗菌谱广,对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌及真菌、霉菌均有明显的抑杀作用,对一些农作物和经济作物病原菌亦有作用。高度耐药的伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等对抗菌肽同样敏感。此外,抗菌肽可以有效杀灭寄生虫,如痢疾、疟疾、chagas氏病、利什曼病的原虫等。另外,有研究表明抗菌肽对流感病毒、疱疹病毒和乙型肝炎病毒等也有抑制作用。值得一提的是,有报道抗菌肽在亚毒性浓度下可抑制艾滋病毒-1(HIV-1)的基因表达,表明抗菌肽对于艾滋病病毒也有抑制作用,这一发现的医学价值是不言而喻的。在肿瘤治疗方面,大部分化疗药物往往同时抑杀癌细胞和正常细胞,具有较大的副作用。而抗菌肽能特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长,对人体正常细胞毒性极低,故极有可能成为无毒或低毒副作用的抗肿瘤新药[3]。1.2抗菌肽的分类自20世纪70年代末从昆虫体内发现抗菌肽以来,已发现300多种这样的内源性抗菌肽,大致可分为4类,即富含Cys残基的defensin(防御素)、富含Pro残基的magainin(蛙皮素)、富含Gly残基的melittin(蜂毒素)和cecropin(杀菌肽)类。按照结构特点可以将其分为4大类[4-5](1)由两到三个二硫键来稳定的β片层结构，分子内含有二硫键,可以稳定抗菌肽的结构,有助于抗菌肽穿过细胞膜。(2)包含一个两性α-螺旋结构，分子内具有α-螺旋结构,通常含有小的弯曲,如cecropin,magainin[6]；(3)片层结构的抗菌肽:缺少典型的二级结构,富含Pro、Gly,其抗菌单位结构是通过肽与膜脂间的氢键或范德华力形成的,而不是通过残基间的氢键,如indolicidin[7]；(4)由单一的二硫键形成的环形结构。1.3抗菌肽的理化性质[16]大小：抗菌肽分子量较小，通常是由6～50个氨基酸残基组成，目前还发现了具有抗菌活性的二肽和三肽。序列：肽序列中常常包含碱性氨基酸残基—赖氨酸或精氨酸，以及疏水性残基——丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或者色氨酸，有的抗菌肽还包含某些氨基酸的重复序列。电荷：阴离子抗菌肽富含带负电的天冬氨酸和谷氨酸，阳离子抗菌肽则富含带正电的精氨酸和赖氨酸。在抗菌活性上，带电荷较多的阳离子肽和含有锌的阴离子肽要明显高于中性的及带电荷较少的抗菌肽。两亲性：抗菌肽具有明显的两亲性，其N端分子富含亲水性氨基酸残基，特别是赖氨酸和精氨酸；而c端则含较多的疏水性氨基酸残基，且大部分被酰胺化。2抗菌肽作用机制抗菌肽对G+菌和G-菌都具有杀灭或抑制作用,其广谱抗菌特性是传统抗生素所无法比拟的,传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶失活变性，来达到杀菌的目的，细菌只要改变一种基因就足以抵抗此类抗生素的攻击。而抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，以此穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能[8]。2.1膜透化作用几乎所有的抗菌肽都是阳离子型的或两亲性的,这一特征决定了它们的抗菌作用模式,抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,造成细菌细胞膜结构破坏引起胞内水溶性物质大量渗出,而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上,抗菌肽分子中的疏水端和两亲性α-螺旋插入质膜中,多个肽分子共同作用形成离子性通道,肽的阳离子部分与微生物膜的阴离子结构相互作用,并最终导致微生物膜的透化，使细菌失去了膜势而死亡。这一过程得到了大多数学者的公认。关于膜透化作用已经提出了许多机制,以下讨论的4种机制是目前根据大量的研究得出的理论。（1）“桶板”模型：数量相对较少的阳离子抗菌肽在电荷的作用下,结合在细胞膜表面并相互聚合,肽分子中的疏水面向外朝向细胞膜的酰基链,而亲水面形成孔或槽,形成横跨细胞膜的离子通道。离子通道一旦形成,外界的水分即可渗入细胞内部,细胞质也可渗透到外部。由于失去能量,严重时细胞膜即会崩解而导致细胞死亡[9]（2）“环形孔”(虫孔)模型：其与“桶板”模型最主要的不同在于脂类与抗菌肽一起形成跨膜通道。（3）“毡毯”模型：阳离子抗菌肽平行排列在细胞壁表面形成类似“毡子”的结构,与其他模型一样,阳离子抗菌肽通过静电作用结合到细胞膜上,覆盖在磷脂双层上,当抗菌肽密度达到一定临界值时,细胞膜能量恶化,完整性丧失,细胞膜出现显著的弯曲从而破裂。此模型中阳离子抗菌肽的疏水部分并不插入细胞膜,细胞膜也并无槽的形成[10]（4）“凝聚”模型：凝聚模型认为抗菌肽插入到细胞膜后,由肽和脂质组成胶束复合物,以凝聚物形式横跨细胞膜,形成动态的孔,抗菌肽透过这种机制也可以进入胞内。与虫孔模型不同,在此模型中抗菌肽没有特定的取向。2.2抗菌肽与细菌胞质内靶目标的作用仅仅是膜通透性的改变不能完全解释抗菌肽的强杀菌作用,在细胞死亡的过程中,细胞膜的透化作用与细胞内功能的破坏相比,对细胞死亡的影响相对较小。有些研究表明细胞膜的去极化并不是抗菌肽杀死靶细胞的充分条件,即抗菌肽与细胞膜作用,在其表面形成短暂性的通道只是进入细胞的中间步骤[11]例如,线性α螺旋的BuforinⅡ具有1个脯氨酸铰链区,它不改变膜的通透性,但可以穿过质膜在胞浆内积累。Magainin-2没有穿膜功能,将BuforinⅡ脯氨酸铰链与magainin-2的螺旋区融合形成的杂合肽能有效地穿过质膜在胞浆内积累[12]。抗菌肽一旦穿过质膜,它可能通过结合DNA阻断DNA复制、抑制RNA合成、影响或阻止蛋白质翻译,抑制正常蛋白质折叠或促使蛋白质错误折叠,抑制与隔膜形成相关的膜蛋白合成而抑制细菌隔膜形成,干扰转糖基作用,抑制肽聚糖生物合成,阻断细胞壁形成,阻断细菌吸收胸腺嘧啶、尿嘧啶、亮氨酸等方式影响细胞正常生理活动,最终导致胞内损伤或死亡。许多抗菌肽穿过细胞膜在细胞内积累并干扰胞内正常功能,引起细菌死亡,因此研究者们认为抗菌肽存在着胞内作用靶点。胞内杀菌机制主要有以下几种胞内杀菌机制主要有以下几种[13，16]：(1)引起胞内物质的絮凝反应,(2)抑制细胞壁生成,(3)与核酸物质相结合,(4)抑制核酸或蛋白质合成,(5)抑制酶的活性,(6)改变细胞膜：抑制隔膜形成。2.2.1抑制细胞呼吸作用线粒体是细胞能量代谢最重要的细胞器。FehlbaumP等发现,当用40μmoL/L的thanatin处理细菌1h后,可监测到细菌的呼吸作用变弱,6h后细菌的呼吸作用就会完全停止。超微结构发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和排列不规则,核膜界限不清,有的核破裂,内容物溢出。提示thanatin是通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌。2.2.2抑制蛋白质及细胞壁合成Pharmacia等的实验表明,对革兰氏阳性菌有强烈抑菌活性的抗菌肽Oxazdidinones通过紧密结合到原核细胞核糖体50S亚基,抑制蛋白合成起始复合物的形成,引起细胞死亡[14]研究发现,麻蝇素Ⅱ(SarcotoxinⅡ)能够抑制细菌细胞壁的形成,使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻,并使细胞壁穿孔,但对已形成的细胞壁不起作用。2.2.3抑制胞外或胞内膜蛋白的形成研究表明[15]Attacins能够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白OmpC、OmpF、OmpA以及LamB基因的转录,使这些蛋白的含量减少,从而导致细胞膜的通透性增加,细菌的生长受到抑制,Apidaecin的抗菌机制假说认为,抗菌肽与大肠杆菌外膜成分结合,而后肽进入细胞外周胞质,通过与结合在细胞内膜的受体分子发生特异性结合,进入细胞内,最后在胞内肽与一种或几种与蛋白合成相关成分结合并发挥作用起到杀菌效果。抗菌肽的作用可能与中止蛋白或DNA的合成,导致这些成分的降解有关。2.2.4作用于核苷酸：(1)通过结合核苷酸抑制其功能:：抗菌肽buforinⅡ能够跨过胞膜磷脂双分子层杀灭细菌而不改变磷脂层的状态和胞膜的完整性，这说明buforinⅡ的抗菌作用可能存在细胞内部的靶点。(2)直接抑制核苷酸的合成：Indolicidin可以干涉人DNA拓扑异构酶-Ι，使人DNA拓扑异构酶-Ι不能正常地松弛DNA超螺旋结构，导致DNA双螺旋不能解旋，从而无法进行DNA的复制。2.3抗菌肽对真菌的作用机制许多抗菌肽除了具有抗细菌的活性外，还具有抗真菌的功能。戴祝英等进行了抗菌肽抗小麦赤霉病的实验，结果表明，适当浓度的抗菌肽对赤霉病菌的抑制率达30%左右。Lijima等从麻蝇幼虫血淋巴中分离出一小肽，能抑制白色假丝酵母生长，命名为AFP。AFP中组氨酸含量高，在抗真菌中起关键作用。随着被发现的抗菌肽的数目不断增多，人们对抗菌肽的抗真菌机理进行了大量的研究，结果表明，抗菌肽的抗真菌机理主要有[17]：第一，阻止