蛋白质组学总结

基因组的局限性全方位蛋白质研究的迫切要求医药研究开发的巨大需求高通量分离、鉴定技术的出现计算机信息科学的有力支持蛋白质组学蛋白质组学诞生的背景第一章功能基因组与蛋白质组§4蛋白质组的基本知识1、概念蛋白质组（proteome）：一种基因组所能表达的全套蛋白质；一种生物中不同细胞的不同蛋白质的组合；一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。2、技术路线与相关技术技术路线蛋白提取样品蛋白混合物双向电泳蛋白图谱肽段酶切消化质谱分析质谱数据数据库检索酶切消化肽段混合物双向电泳数据库第二章蛋白质组研究方法蛋白质组的技术基础（三大支撑技术）：双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术：多维色谱与质谱联用：大规模蛋白质分离与鉴定同位素编码亲和序列标签技术（ICAT）：简化样本、定量。酵母双杂交技术和免疫共沉淀（CoIP）：蛋白质间相互作用§2大规模的蛋白质提取、分离技术弥补以2-DE/MS为基础的蛋白质组技术方法的不足。1、二维色谱—串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS）主要特点：快速（1-2小时）；易于和质谱连用（液相系统，避免胶上回收）；适用于各种蛋白质的分离（疏水性蛋白、偏酸偏减性蛋白、过大过小的蛋白）。二维色谱有多种组合模式：第一维常用离子交换色谱或凝胶过滤色谱。第二维常用反相色谱。二、色谱—质谱技术2、同位素—亲和标记—质谱技术（ICAT）细胞中蛋白质数目巨大，酶切后的多肽混合物十分复杂，现有的2-DE和2D-HPLC都难以完全分离。1999年Gygi等人发明同位素亲和标签技术（IsotopeCodedAffinityTags，ICAT），可以简化样本，并有定量作用。ICAT试剂由三部分组成：①活性基团，能特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基；②连接子，用于结合稳定的同位素；③生物素，作为亲和标签，能与卵白素结合，用于选择分离标记的多肽。（卵白素可结合在固相支持介质。）ICAT试剂由三部分组成：X代表8个氢或者氘原子与蛋白中Cys的-SH连接用于被标记多肽的亲和纯化生物素连接部分（重链或轻链）巯基特异反应基团首先，对蛋白质进行标记。接下来，蛋白酶切—形成多肽混合物。然后再使用亲和色谱分离——只有标记肽段被保留（先洗脱下未标记肽段，再改变洗脱条件，洗脱下别标记肽段）。这样，使样品变得简单。比较标记了重链和轻链的肽段在质谱图中的信号强度，这样，可以实现对差异蛋白质的定量分析。C-ICATC-ICATC-ICATC-ICATC-ICATC-ICAT亲和分离-ICATC酶切质谱分析-ICATC§1细胞裂解的方法一、温和的裂解方法用于比较简单的样品：组织培养的细胞，血细胞、微生物或细胞器。1）渗透裂解：低渗溶液悬浮细胞。2）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞(1-2min)，随后在37℃融化(1-2min)，反复几次。第三章双向电泳的蛋白质提取与样品制备3）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲液重悬细胞。4）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。等渗缓冲液含有某种酶：溶菌酶（lysozyme）——细菌纤维素酶（cellulase）和果胶酶（pectinase）——植物细胞溶细胞酶(lyticase)——酵母细胞上述方法有时可以联合运用，裂解效果更好。二、剧烈的裂解方法用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。1）超声裂解法。2）弗氏压碎法。3）研磨法。4）机械匀浆法。5）玻璃珠匀浆法。三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。如有可能，可加入强变性剂：8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS。但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。分离策略：沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白质。附带作用：浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。注意：某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。四、通过沉淀分离蛋白1）硫酸铵沉淀（盐析）。2）TCA沉淀（三氯乙酸沉淀）。3）丙酮沉淀。4）在冰丙酮中用TCA沉淀。5）苯酚提取，然后在甲醇中用醋酸铵沉淀。沉淀方法五、清除影响二维电泳图谱的杂质一方面，沉淀分离蛋白，另一方面除去杂质：1）盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子。2）内源性小分子。3）离子去污剂。裂解液中的SDS会影响第一向电泳，需以含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液（或重泡涨液）将SDS稀释至终浓度低于0.25%，或其它去污剂与SDS的比率为8:1。亦可用丙酮沉淀方法去除SDS。4）核酸（DNA,RNA）使用DNase和RNaseA混合处理样品。§2蛋白质的分步提取技术硫脲、sulfobetaine和TBP可极大提高样品的溶解度，联合运用硫脲、表面活性剂SB3-10和TBP，可构成高效IEF裂解液，溶解传统方法难以溶解的蛋白。1998年，Molloy把分步提取法和高效裂解缓冲液联合起来，得到高分辨率的2-DE图谱。具体步骤：第一步——以水溶液提取（只溶解偏亲水性蛋白）。第二步——以含Urea/CHAPS/DTT的溶液提取（传统裂解，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白）。第三步——以含硫脲/SB3-10/TBP的溶液提取（主要溶解疏水性蛋白）。有实验表明，11个大肠杆菌的膜蛋白在第三步提取出来。第四章双向电泳与蛋白质分离利用了蛋白的两个特性对其进行分离。第一向等点聚焦电泳——利用蛋白的等点电进行分离第二向SDS—PAGE——利用蛋白的相对分子量分离原理§1等点聚焦电泳原理构成蛋白质的氨基酸是两性电解质，决定了蛋白质的在一定的pH条件下带有电荷。在低pH条件下，蛋白质所带电荷为正；在高pH条件下，蛋白质所带电荷为负。在某一pH条件下，蛋白质所带净电荷为零时；则此pH为该蛋白的等电点(pI)。蛋白质的等电点取决于蛋白质的氨基酸组成，是蛋白质的一个物理化学常数，可以据此特性分离蛋白质。+———+pH7.0+pH7.0pH9.0pH4.0pH9.0pH4.0实现聚焦据此，设计含有pH梯度的凝胶，在外加电场作用下，蛋白质向与它的等电点一致的pH处泳动，直至聚焦于该处。———+pH7.0pH9.0pH4.0pI大于pH7IPG胶条的平衡在第一向等点聚焦电泳结束之后，第二向电泳进行之前，必须对胶条进行平衡。平衡第一步的作用是让蛋白变性，当SDS单体浓度高于1mmol/L时，与蛋白定量结合(1g蛋白/1.4gSDS)，掩盖蛋白所带电荷，并使构象均呈雪茄装。平衡的第二步是以碘乙酰胺代替第一步中使用的DTT，否则DTT会影响SDS-PAGE的电泳效果。§2SDS—PAGE原理在电场的作用下，带电粒子能在凝胶中迁移，迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键，所以可使寡聚体解聚成亚基；在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下，蛋白质分子内的二硫键被打开。这样，解聚后的多肽分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，其所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。所带电荷多少与分子大小呈正比（即各种蛋白亚基的荷质比基本一致）。再者，多肽-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒，不同的蛋白质亚基-SDS复合物所形成的椭圆棒的短轴基本上相同，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。因此，这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷与构型的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。§3胶上蛋白检测一、考马斯亮蓝染色特点：简单、无毒性、对比度好、与下游蛋白鉴定方法兼容。缺点：检出限10ng、修饰谷氨酸侧链，费时（24-48h）二、银染特点：灵敏度200pg。缺点：醛类特异反应是胶上酶切后肽的回收有一定困难。先银染，再加大上样量进行2-DE，考染，质谱鉴定。第五章图像分析与细胞蛋白谱的建立完成2-DE后，凝胶图像要扫描保存，以数字化图像的形式储存起来。工作步骤：1、蛋白质点检测2、背景消减——扣除背景染色对蛋白丰度计算的影响。3、归一化处理——使不同胶上同一蛋白质点准确地相对定量，进行比较。4、蛋白质点匹配质谱（MassSpectrometry,MS）特殊的天平：称量离子的质量依据不同方式将样品离子按质荷比m／z分开质量分析器离子源检测器第六章生物质谱技术与蛋白质鉴定一、MALDI离子源原理分析物分散于基质中，形成晶体激光束辐射到基质和样品分子上基质吸收激光束能量后汽化，部分样品分子伴随基质的汽化而解吸，基质与样品之间发生电荷转移，样品分子电离§1基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱特点之一：产生的离子多为单电荷离子——谱峰与样品各组分的质量数又一一对应关系，所以MALDI最适宜分析多肽及蛋白混合物。基质为小分子有机酸及其衍生物，由于：极性化合物溶解样品芳环吸收激光易结晶均匀分散样品分子二、线形飞行时间质量检测器MALDI离子源通常用飞行时间(timeofflight,TOF)检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。离子源++++检测器激光线形MALDI-TOF原理图Uacc高真空无场飞行管脉冲激光使样本离子化，在外加电场作用下获得动能，进入高真空无电场飞行管道，以在加速电场内获得的速度飞行。质量较小的离子飞行速度快，到达检测器早；质量较大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。§2肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术特定的质量，且产生的片段数目亦有特异性，故称指纹谱。肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting,PMF)是指蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有为什么要酶切蛋白样品？蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。此外，酶切产生肽段数目固定，是肽质量指纹图谱的重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。常用酶类要求：水解为点专一；切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索；酶自身稳定，不易降解。常用酶类：胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。§3液相色谱—电喷雾—串联质谱一、电喷雾电离源的工作原理利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流作用下：液滴溶剂蒸发——表面积减小——表面电荷密度不断增加——库伦斥力与表面张力达到雷利极限——液滴爆裂为带电的子液滴；这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离子形式进入质量分析器。电喷雾电离产生多电荷离子：可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。多电荷离子的有关计算：对于蛋白质，产生的多电荷离子为：[M+nH]n+系列离子。假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为[M+nH]n+,另一相邻质谱峰(m/z)2对应的离子为[M+(n+1)H](n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:1)))/(n1n((M(m/z)n)/n(M(m/z)21解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。二、液相色谱—电喷雾—串联质谱(LC-ESI-MS/MS)ESI后连接串联质谱，可检测离子结构碎片和质荷比，提供离子