RNA的转录

4.1RNA合成的基本特征以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；碱基为：A、U、C、G以DNA为模板；按5′-3′方向合成；在体内DNA双链中仅一条链作为模板;RNA的序列和模板是互补的;转录时DNA-RNA杂合双链分子是不稳定的，RNA链很快被游离的DNA所取代，DNA又恢复双链状态。4.2RNA合成的酶学聚合的过程中不需要引物；需要双链的DNA作为起始的模板；Mg2+对RNA聚合酶的活力是必需的；所有的RNA聚合酶没有3’-5’的外切活性，具有10-5-10-4左右的出错率；通常是多亚基结构，但也有单亚基的情况，例如噬菌体T3、T7的RNA聚合酶是单肽，而且移动速度为200nt/sec。4.2.1E.coliRNA聚合酶与起始和延伸相关仅与起始相关36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD40nt/sec•由rpoB基因编码；•RNA合成的催化中心；•利福平（Rifampicin）能结合该亚基，从而抑制RNA转录;•β亚基也许包含两个domain，分别负责RNA转录的起始和延伸。β亚基•由rpoD基因编码；大肠杆菌编码几个σ因子，此处的σ因子称为σ70；•决定RNA聚合酶在启动子区域正确起始，如果没有σ因子，RNA的转录将可以在任一DNA模板区域起始；•当正确起始，RNA链延伸到8-9nt时，σ因子脱落。σ亚基20种氨基酸的平均分子量为138道尔顿，小分子氨基酸出现的频率较大因此加权平均分子量为128，在此基础上减去一分子被脱去的水分子量，即128-18=110。所以“氨基酸残基”的平均分子量通常按110计算。知识点补充4.2.2真核RNA聚合酶包含三种RNA聚合酶•RNAPolⅠ存在核仁中，转录rRNA（5.8S、18S、28S）;•RNAPolⅡ存在核质中，转录mRNA与snRNA（核内小RNA）;•RNAPolⅢ存在核质中，转录tRNA与5SRNA。三种RNA聚合酶的大小均在500KDa，包含两个大亚基和4-8个小亚基。4.3原核生物的启动子结构ATACGTATGCpromoterterminatorTranscribedregionRNADNATranscriptionAntisensestrandAUACG以大肠杆菌乳糖操纵子为例把开始转录的第一个碱基定义为+1，因此启动子区域为负数标志；启动子区域一般包括40-60bp;-55to+20：与RNA聚合酶结合；-20to+20：与RNA聚合酶紧密结合，可以避免DNAaseⅠ的消化；+1to-40：对启动子的功能是非常关键的；-10&-35区域：是非常关键的启动子区域。---5-8bp---ACTGTTGACATATAAT---16-18bp----35sequence-10sequence4.3.1-10区(Pribonowbox)•长度6bp，分布在位置-10的两侧；•保守序列为：TATAAT，TATPuAT更加合适；•前两个碱基和最后一个碱基在大肠杆菌所有的基因中都是极其保守的：T80A95T45A60A50T96;•这个六聚体距离+1大概5-8bp，这个距离对于启动子的活性是非常关键的。4.3.2-35区(Sextamabox)•在–35位置附近的一个保守的六聚体；•保守序列为T82T84G78A65C54A45，•在大肠杆菌所有的启动子中，前三个碱基(TTG)是非常保守的；•在90%的启动子中，-35区与-10区的距离一般保持在16-18bp之间。大肠杆菌中不同基因启动子序列比较-10区与-35区控制转录强度•在σ因子的辅助下，RNA聚合酶首先与-35区结合，由于RNA聚合酶能覆盖60-70个bp的DNA序列，因此酶分子的某个区域能到达-10区域，并随即与其结合；•三种因素控制启动子的强度：•-35区与RNA聚合酶的亲和性；•-10区的碱基可以影响开放启动子复合物的形成速率；•-10区与-35区之间的距离决定了启动子的效率，17bp是最佳间距。4.3.3CAP位点•当体系中同时存在葡萄糖和乳糖的时候，大肠杆菌对乳糖是不理睬的，这是为什么呢？•当细胞缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP环化为cAMP，后者与其受体蛋白CAP结合，这个复合物再与启动子上的CAP位点结合，只有这样，乳糖启动子才能与RNA聚合酶结合，起始转录。当有葡萄糖存在时，cAMP无法形成……•乳糖操纵子存在两个CAP位点•-70to-50：具有一个反向重复序列•-50to-40：位点1的结合促进了位点2的结合•乳糖操纵子的-10区碱基序列为TATGTT，由于中心存在G:C碱基对。使得RNA聚合酶无法解开双链进行转录起始；•CAP-cAMP复合物的结合，使得CAP2附近的G:C稳定性降低，使得RNA聚合酶能顺利解开DNA双链，起始转录；•如果把-10区的碱基序列从TATGAT突变成TATAAT，细胞将能同时利用葡萄糖和乳糖。CAPCAPRNA聚合酶σ-60-45-35-10TATGTT4.4真核生物的启动子结构三种聚合酶有多种不同的启动子；•RNAPolⅠ转录rRNA（5.8S、18S、28S），仅包含一种类型启动子;•RNAPolⅡ转录mRNA与snRNA，启动子非常复杂;•RNAPolⅢ转录tRNA与5SRNA，启动子位于转录区域内。本节介绍RNAPolⅡ与RNAPolⅢ4.4.1RNA聚合酶Ⅱ•启动子具有四个保守部分，前三个一般都具备：•帽子位点转录起始位点，碱基多为A，两侧为若干嘧啶，这与原核生物的“CAT”规律一致；•TATA框-25位置附近，与原核Pribnow框的作用一致，序列的保守性为：T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）；•CAAT框-75位置附近，一致序列为GGC（T）CAATCT，控制转录起始效率；•增强子远上游序列。增强子•有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中；•增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍；•大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的；•增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；•没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；4.4.2RNA聚合酶Ⅲ•分为两类•转录5SRNA的启动子：A区（+50-+60）与C区（+80-+90）；•转录tRNA启动子：A区与B区•转录需要共同转录因子的作用：TFⅢA、B、C；4.5转录的起始与延伸σ亚基发现启动子区域全酶与-35区结合全酶向-10区转移并牢固结合-10区与起始位点之间局部解链(12-17bp)，开放性启动子复合物形成RNA聚合酶被核苷酸前体充满β亚基催化形成第一个磷酸二酯键σ亚基开始脱落，使RNA聚合酶与DNA链的结合处于非特异性状态，便于RNA聚合酶在链上的滑动新生成的RNA链与模板DNA形成的杂和链非常短，估计在2-10个碱基左右，而DNA复制时的RNA引物可达50-60bp，Why?转录终止4.6转录的终止转录的终止信号存在已经转录的RNA序列中，提供终止信号信号的这段DNA序列称为终止子。主要特征•转录终止点前有一段回文序列，能形成茎环或发卡结构转录终止子有两种类型：•不依赖ρ因子具有茎环或发卡结构，多聚U尾巴•依赖ρ因子具有茎环或发卡结构，需要Rho因子辅助4.6.1茎环或发卡5‘NNNNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUU-OHNNNNCG•CC•GC•GG•CC•GG•CA•UA•U…NNNNUUUU-OH4.6.1终止原理发卡结构形成以后，会与RNA聚合酶以某种特定的结构嵌合，使RNA聚合酶会出现一定时间的延滞，这是如果发卡结构后面的RNA序列为寡聚的U或A，杂和双链由于结合力比较若，就会发生分离，如果没有这样的多聚U/A结构，则需要Rho蛋白来辅助终止。4.6.3Rho因子的终止原理•ρ因子是六聚体，具有NTPase酶活性（只有RNA链长超过50时才具有）；•ρ因子一般认为从RNA的5’端结合上去，也有学者认为存在特定的结合区域；•ρ因子沿着转录出的RNA移动要比RNA聚合酶延DNA移动快。当RNA聚合酶达到终止子时就暂停下来，那么在此位置ρ就会追上RNA聚合酶。ρ因子可通过与RNA聚合酶β亚基的直接作用，使RNA聚合酶从转录复合体脱落下来；•当然发卡结构后的序列也要求有比较低的接合能力，如果低到一个更低的数值，该终止子也就成为不依赖ρ因子的终止子了。4.6.3无义突变的极性效应•在翻译比较旺盛时，原核细胞转录和翻译同时进行，由于核糖体挡道，ρ因子很难追上RNA聚合酶。因此在一个操纵子中，前一个基因内部的无义突变可使ρ因子追上RNA聚合酶，使得后随基因表达受阻。4.7转录后处理pre-RNAcappingtailingsplicingmethylationEtc.matureRNA4.7.1帽子•真核生物的转录起始位点可以是pppA或者pppG，但真实的情况却总是N7甲基鸟苷酸打头，并且通过5’-5’磷酸二酯键与下一个核苷酸连接，why?；•真核生物通过一系列的反应在5’端加上了帽子，不同的真核生物有不同的帽子结构：Cap-0m7GpppXpYp-------(单核真核)Cap-1m7GpppXmpYp-------（高等真核）Cap-2m7GpppXmpYmp-------（10-15%高等真核的mRNA）mRNAcappingproceedingAfter30±nttranscription，pre-RNAcappingstarts5’pppXpY---------------------(30Nt)-3’(pre--RNA)pippXpY-----GTPSAMppXpYp-----------m7GpppXpYp----------RNA鸟苷转移酶（加帽酶）RNA鸟嘌呤-7-甲基转移酶SAHppiGp-(withCap-0)核苷磷酸水解酶SAMSAMm7GpppXmpYp----------m7GpppXmpYmp----------SAM:S-腺苷基-L-甲硫氨酸SAH:S-腺苷基-L–同型半胱氨酸RNA核苷-2’-O-甲基转移酶RNA核苷-2’-O-甲基转移酶GpppXpYp-------------m7SAH(withCap-1)SAH(withCap-2)帽子结构的功能•1）有助于mRNA越过核膜，进入胞质；•2）保护5’端不被核酸酶降解；•3）翻译时供IFIII(起始因子)和核糖体识别。Thecapbindingproteincomplex(CBC)bindsthecap:thisisneededwhenthemRNAisexportedfromthenucleus.4.7.2尾巴•poly-Atailisaddedintwomainsteps:1.在切割位点前13-20bp的位置存在AAUAAA序列，可被切割及多聚腺苷化特异因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor，CPSF）识别结合,后者促进切割核酸内切酶CStF切割CA位点，在切割位点后还存在保守序列GUGUGUG；2.Poly-A多聚酶然后增加100-200A,PolyA与蛋白结合。4.7.3基因间序列的去除•在原核生物和真核生物中，许多功能相近的基因会组合在一个称作操纵子的结构内，由同一个启动子起始转录，转录出一条多基因的RNA。有些RNA是遗传信息的最终产物，比如rRNA、tRNA，因此需要将每个基因切割开来。rRNA的转录后处理•原核生物•三种rRNA：5S、16S、23S；分别含有120、1541、个2904核苷酸；rRNA基因混排在同一个30S转录产物中，大肠杆菌具有７个这样的操纵元；•RNAaseⅢ负责将每个RNA片段分开，在前体RNA转录产物的双链位置切开RNA链；•真核生物•四种rRNA：5.8S、18S、28S、5