ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书

网站/Web:咨询热线/Tel:[phone]销售/Sales:[e-mail]技术支持/Support:[e-mail]技术服务/Service:[e-mail].,LtdVersion3.2ClonExpressTMIIOneStepCloningKit产品概要产品组成贮藏条件实验方案参考实例注意事项常见问题与解决方案01/02ClonExpressTM快速克隆技术ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。ClonExpressTMII是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶ExnaseTMII。和上一代产品相比，ExnaseTMII中添加了独特的重组增强因子。一方面，这种增强因子可以显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞(107cfu/μg)也可实现高效克隆(100cfu/ngVector)。另一方面，ExnaseTMII还兼容常规酶切、PCR反应体系。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。产品优点-简单、快速、高效-适用于向几乎任何载体的任何位点进行定向克隆-无需考虑插入片段自身携带的酶切位点-可高效克隆50bp～10kb片段-不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上-线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围-快速克隆-高通量克隆-无缝克隆-DNA定点突变组分C112-01(25rxn)C112-02(50rxn)5×CEIIBufferExnaseTMII500bpcontrolinsert(25ng/μl)pUC19controlvector,linearized(50ng/μl)100μl50μl5μl5μl200μl100μl5μl5μlCatalog目录).线性化克隆载体制备(参见4.2)；2).插入片段扩增引物设计(参见4.3)；3).插入片段PCR扩增(参见4.4)；4).进行重组反应(参见4.5)；5).反应产物转化、涂板(参见4.6)；6).克隆鉴定(参见4.7)。选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。A线性化克隆载体由酶切制备双酶切线性化：线性化完全，转化背景(假阳性克隆)低。推荐使用。单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如HindIII，65℃孵育20min完全失活)后可直接用于重组反应。B线性化克隆载体由反向PCR扩增制备注：ClonExpressTMII重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆(无插入片段)是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl(重组反应总体积的1/5)。克隆载体酶切产物或PCR扩增产物DNA纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(5kb)克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA纯度并去除一部分未线性化的环状载体(电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增(PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase,Vazyme,P501)以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。ClonExpressTMII重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。表一：线性化克隆载体的使用方式线性化载体制备方式快速实验方案最佳实验方案模板类型PCR制备有明显非特异性扩增环状质粒环状质粒预线性化质粒、基因组、cDNA加热失活内切酶后直接使用扩增特异DpnI消化后直接使用(降解扩增模板)直接使用酶切消化制备胶回收胶回收胶回收胶回收或DpnI消化后胶回收图一：使用ClonExpressTMII进行基因克隆实验流程用于重组反应的克隆载体必须为线性化载体。该线性化载体可通过内切酶消化环状载体获得，也可由反向PCR扩增环状载体获得(图，上左)。插入片段由PCR扩增制备。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加线性化克隆载体末端序列(图中以红色和蓝色标记)。使用该引物对扩增插入片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致(图，上右)。以线性化克隆载体和插入片段扩增产物配制重组反应体系，37℃反应30min即可完成重组反应，实现两线状DNA的体外环化(图，中)。重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选(图，下)。本产品应置于-20℃储存。ClonExpressTMII引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)。以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。05/06图二：重组引物设计方案插入片段可用任意PCR酶(Taq酶或高保真酶)扩增，无需考虑产物末端有无A加尾(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase,Vazyme,P501)，以减少扩增突变的引入。PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。ClonExpressTMII重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(5kb)克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。ClonExpressTMII重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：最适克隆载体使用量=[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)最适插入片段使用量=[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)例如，将长度为2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：0.02×5000=100ng;插入片段最适使用量应为：0.04×2000=80ng。注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。ddH2O5×CEIIBuffer线性化克隆载体插入片段扩增产物ExnaseTMIIUpto20μl4μl50200ng20200ng2μl表二：扩增产物推荐使用方式注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl(重组反应总体积的1/5)*当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20min将DpnI失活，以避免重组反应时残留DpnI对克隆载体的降解。PCR扩增情况预线性化质粒、基因组、cDNA直接使用胶回收胶回收或DpnI消化后胶回收胶回收DpnI消化后直接使用*有明显非特异性扩增PCR模板类型快速实验方案扩增特异与克隆载体抗性相同的环状质粒最佳实验方案07/081.当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体/克隆载体当做插入片段进行计算。2.线性化克隆载体的使用量应在50～200ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20～200ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。例如，插入片段长度为100bp，最适使用量计算值为4ng，实际反应体系内使用量应为插入片段扩增产物最少使用量20ng。3.线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4μl。注意:最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50μlLB培养基中混匀，直接取1μl作为PCR模板。我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。注意:我们推荐您使用转化效率108cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率108cfu/μg(例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107cfu/μg之间)，请将培养菌液在5000rpm离心3min收集菌体，用100μlLB培养基重悬后全部涂板。取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。加入900μlSOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。注意:我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。ClonExpressTMII快速克隆试剂盒中提供500bpcontrolinsert(25ng/μl)和pUC19controlvector,linearized(50ng/μl)各5μl，需要时可进行阳性对照反应，每次反应各加1μl。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。实验目标:在pUC19载体的EcoRI和HindIII酶切位点间插入一段500bp的基因。1)插入片段引物设计根据图二双酶切引物设计方案，设计引物如下(图三)：M：DNAMarkerIII。上样5μl，除1.2kb条带为100ng以外，其余条带DNA量均